利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)建立新型冠狀病毒核酸快速檢測方法

李 歡，徐秋月，王云娟，蘇 洋，唐睿珠

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南省實(shí)驗(yàn)診斷研究所，云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032）

2019 年 12月，我國武漢市報(bào)道了多例病原體不明的肺炎病例，隨后在全中國乃至世界多國暴發(fā)流行。2020 年 1 月 7 日，ZHOU 等[1]通過病毒分離和基因組測序，發(fā)現(xiàn)引起該肺炎的是一種新型冠狀病毒。國際病毒分類委員會將其正式命名為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[2]。SARS-CoV-2屬于β冠狀病毒屬，其基因組為單鏈正股RNA，長度為29 881個(gè)核苷酸[3]。SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）傳染性強(qiáng)，人群普遍易感，目前全球的疫苗普及率還有待提高，因此及早發(fā)現(xiàn) SARS-CoV-2 感染者并進(jìn)行有效的隔離與治療，仍是當(dāng)下控制疫情最有效的方法。核酸檢測是確診 SARS-CoV-2 感染的最主要的依據(jù)，血清學(xué)抗體檢測是重要的補(bǔ)充方法。目前可用于 RNA 病毒的核酸檢測技術(shù)主要有基因測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片和恒溫核酸擴(kuò)增等。其中Real-Time qRT-PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR）檢測方法是首選方案[4]，但該法對操作人員、設(shè)備以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等要求較高。基因測序和基因芯片技術(shù)需要特殊設(shè)備，如測序儀、電泳儀及凝膠記錄系統(tǒng)等，且存在檢測周期長、操作復(fù)雜等諸多不便因素。這些方法并不適用于現(xiàn)場、基層醫(yī)療單位及資源貧乏的環(huán)境下使用。云南省位于我國邊境，防疫情輸入壓力巨大，邊境地區(qū)條件有限，因此疫情防控工作中需要采用高性能、快速且易操作的方法來進(jìn)行新冠病毒核酸檢測。

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是新發(fā)展起來的一種核酸檢測技術(shù)，由于其擴(kuò)增不需要變溫循環(huán)的特點(diǎn)受到關(guān)注，有望成為分子診斷中PCR的替代技術(shù)[5-6]。不同于常規(guī)PCR方法，恒溫?cái)U(kuò)增方法不需要變溫儀器和多個(gè)熱循環(huán)程序，只需要在一個(gè)恒定的溫度下就可對核酸進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。其中逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（RT-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是在恒溫條件下，利用鏈置換DNA聚合酶和針對靶基因6～8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4～6條引物即可實(shí)現(xiàn)對RNA進(jìn)行快速（擴(kuò)增時(shí)間通常小于1 h）高效（大于109倍）擴(kuò)增的檢測技術(shù)。并且反應(yīng)結(jié)束之后，不需要儀器，憑借肉眼觀察顏色變化即可知道擴(kuò)增結(jié)果為陰性或陽性。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在儀器需求、檢測效率、操作方法、結(jié)果判讀等方面均具有優(yōu)勢，非常適合在條件有限的環(huán)境下使用。

1 材料與方法

1.1 新型冠狀病毒核糖核酸基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

筆者從中國計(jì)量科學(xué)研究院訂購了編號為GBW（E）091099的新型冠狀病毒核糖核酸基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為人源核糖核酸基因組，含有新型冠狀病毒全部基因，包括全長的特征核殼蛋白N基因和開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因。N基因濃度為1.73×103copies/μL，ORF1ab基因濃度為8.96×102copies/μL。

1.2 核酸提取

新冠病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用DNA/RNA磁珠法核酸提取試劑盒（天隆科技有限公司，西安，中國）提取，按廠家說明書進(jìn)行操作。提取好的核酸放置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

為了鑒定SARS-CoV-2，選擇其特異性的ORF1ab基因和N基因作為目標(biāo)基因，從GeneBank下載這兩個(gè)目標(biāo)基因的序列。參照疾病預(yù)防控制中心（CDC）公布的特征核殼蛋白N基因和開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因檢測靶位[7]附近，采用Geneious10.2.3軟件將各序列段與SARS病毒、MERS病毒和甲乙流感病毒序列進(jìn)行比對，以確保所選序列的特異性，并用primer explorer V.5（http://primerexplorer.jp/e/）軟件設(shè)計(jì)各靶基因的LAMP反應(yīng)引物：F3，B3兩條外引物和FIP，BIP兩條內(nèi)引物以及LF或LB環(huán)引物，各亞型引物序列見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 RT-LAMP引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-LAMP

1.4 RT-LAMP反應(yīng)

LAMP檢測試劑為WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master 1.4 mM的dNTP Mix，320 U的Bst3.0 DNA Polymerase），2.5 μL 引物混合液（FIP、BIP各40 pmol，B3和F3為5 pmol，LB為20 pmol），1 μL cDNA模板，9 μL Rnase free水。RT-LAMP擴(kuò)增條件為65 ℃、60 min，擴(kuò)增儀器使用基因擴(kuò)增儀（天隆Genesy 96T，西安，中國）。當(dāng)試劑反應(yīng)體系由紅色變?yōu)辄S色時(shí)結(jié)果判斷為陽性，若始終為紅色則為陰性。

1.5 特異性評價(jià)

將新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于特異性評價(jià)，先提取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的RNA，再用針對ORF1ab基因和N基因兩套引物分別進(jìn)行RT-LAMP檢測，以甲型、乙型流感病毒質(zhì)粒以及滅菌注射用水為模板作陰性對照。以新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板時(shí)，結(jié)果應(yīng)為陽性；以甲乙流感病毒質(zhì)粒以及去離子水為模板時(shí)，結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.6 最低檢測限評價(jià)

將提取出的新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（N基因濃度 為1.73×103copies/μL，ORF1ab基因濃度為8.96×102copies/μL）用 DEPC水（diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）稀釋至0.50×103copies/μL（目前臨床常用的商品化qRT-PCR試劑的最低檢測限）附近。N基因濃度稀釋為0.87×103copies/μL、0.50×103copies/μL、0.40×103copies/μL。ORF1ab基因濃度稀釋為0.60×103、0.50×103copies/μL。準(zhǔn)備10份原濃度和各稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后分別提取核酸，再采用RT-LAMP方法進(jìn)行檢測，以陽性檢出率為100%的最低濃度為該目標(biāo)基因的最低檢測限濃度。

1.7 抗干擾能力評價(jià)

以一例正常人新鮮血液樣本、一例鼻腔分泌物、滅菌注射用水和細(xì)胞保存液樣本分別作為干擾物，各吸取20 uL（按提取樣本體積的10%）加入到稀釋至最低檢測限的新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和滅菌注射用水中參與提取，然后用RT-LAMP方法進(jìn)行檢測。加入干擾物后，檢測結(jié)果的陰陽性應(yīng)不受影響。

1.8 最佳反應(yīng)時(shí)間評價(jià)

觀察以稀釋至各基因最低檢測限的新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板在不同的RT-LAMP擴(kuò)增時(shí)間（40 min，50 min，60 min）的反應(yīng)結(jié)果，以權(quán)衡選擇最佳的反應(yīng)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 特異性評價(jià)

設(shè)計(jì)針對新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因出的2套內(nèi)、外引物，并在其中篩選出的一套最佳引物和相應(yīng)的環(huán)引物。以新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板時(shí)，RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果應(yīng)為陽性；以甲型、乙型流感病毒質(zhì)粒和滅菌注射用水為模板時(shí)，RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果為陰性（圖1）。

圖1 特異性評價(jià)Fig.1 Evaluation of specificity

2.2 最低檢測限評價(jià)

采用RT-LAMP方法將10份原濃度和各稀釋濃度的新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測，以100%陽性檢出率的最低濃度為該目標(biāo)基因最低檢測限。因此ORF1ab基因的最低檢測限為0.60×103copies/μL（圖2），N基因的最低檢測限為0.50×103copies/μL（圖3）。

圖2 ORF1ab基因的最低檢測限評價(jià)Fig.2 Evaluation of limit of detection of ORF1ab gene set

圖3 N基因的最低檢測限評價(jià)Fig.3 Evaluation of limit of detection of N gene set

2.3 抗干擾能力的評價(jià)

針對新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因2套試劑體系在新型冠狀病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（模擬陽性樣本）和滅菌注射用水（模擬陰性樣本）中的抗血液、鼻分泌物和樣本保存液干擾能力良好，陰陽符合率均為100%（圖4）。

圖4 抗干擾能力評價(jià)Fig.4 Evaluation of anti-interference ability

2.4 最佳反應(yīng)時(shí)間評價(jià)

為了評估新型冠狀病毒ORF1ab基因和N基因RT-LAMP的最短擴(kuò)增時(shí)間，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至最低檢測限附近進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，在40 min，50 min，60 min時(shí)結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果表明ORF1ab基因在50 min變?yōu)殛栃裕琋基因在40 min變?yōu)殛栃裕▓D5）。并且N基因在40 min仍然為陽性。因此，50 min為該體系的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.5 結(jié)果的判讀

在SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白是最保守的，檢測序列特異性的N基因可作為冠狀病毒屬初步篩選的靶位。ORF1ab基因的同源性較低，可作為區(qū)分SARS-CoV-2與其他冠狀病毒的重要靶位。因此，聯(lián)合N基因和ORF1ab基因的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析，可盡量避免樣本漏檢和假陽性。因?yàn)楸驹噭w系是對兩個(gè)基因分別進(jìn)行檢測，所以其實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)綜合分析，對于結(jié)果的判讀見表2。

表2 RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的判讀Tab.2 Strategies for judging RT-LAMP results of SARS-COV-2

3 討論

雖然目前我國已經(jīng)有效控制住了新型冠狀病毒的傳播，進(jìn)入疫情防控常態(tài)化階段，但境外新冠肺炎疫情仍然呈暴發(fā)蔓延態(tài)勢。云南省位于我國邊境與多個(gè)國家接壤，并且近期鄰國緬甸國內(nèi)爆發(fā)政變，導(dǎo)致邊境城市疫情輸入和擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)劇增。根據(jù)目前最新版新冠肺炎診療方案，確診新型冠狀病毒肺炎的首要標(biāo)準(zhǔn)仍為新冠病毒核酸陽性，而新冠病毒特異性抗體僅作新型冠狀病毒核酸檢測的補(bǔ)充指標(biāo)，不能完全作為新冠肺炎的確診依據(jù)。qRT -PCR 法是目前檢測新冠病毒核酸最常用方法，但對操作人員、設(shè)備以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等要求較高[8]，對于實(shí)驗(yàn)條件有限的邊境地區(qū)不太適用，因此在邊境疫情防控工作中需要采用高靈敏、易操作、檢測周期短的方法來進(jìn)行新型冠狀病毒肺炎核酸檢測。

核酸擴(kuò)增技術(shù)分為2大類：一類是以PCR為代表的非恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，另一類則是恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。近年來核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展與完善。其中，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)只需在某個(gè)恒定的溫度下、一個(gè)反應(yīng)步驟即可擴(kuò)增特異性核酸片段。該技術(shù)不需要精密的儀器對反應(yīng)體系進(jìn)行反復(fù)升降溫，同時(shí)省去了多個(gè)循環(huán)進(jìn)行變性、退火和延伸的耗時(shí)過程。并且LAMP技術(shù)的一個(gè)明顯優(yōu)勢是可進(jìn)行高通量檢測，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)本的連續(xù)檢測。由于該技術(shù)對引物設(shè)計(jì)要求很高，針對靶基因上6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物，因此大幅提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。并且對于反應(yīng)結(jié)果的判讀簡潔明了，只需要肉眼觀察有無擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物生成就可以確認(rèn)是否有靶基因存在。LAMP技術(shù)簡單、快速、特異性強(qiáng)，去除了精密復(fù)雜的儀器設(shè)備的限制，反應(yīng)時(shí)間短，結(jié)果判讀簡潔直觀[9-10]。因?yàn)榉磻?yīng)溫度恒定，在檢測過程中可不斷插入新樣本而對之前的反應(yīng)不會造成影響，因此可實(shí)現(xiàn)標(biāo)本高通量的自動(dòng)化檢測，十分適合在邊境地區(qū)推廣和應(yīng)用。常用的LAMP 擴(kuò)增結(jié)果的目測方法有濁度指示法、熒光染料法以及指示劑顯色法等。濁度指示法是在試劑體系中加入鈣黃綠素，在反應(yīng)結(jié)束后就可通過擴(kuò)增產(chǎn)物的渾濁度來判讀陰陽性。熒光染料法通常以 SYBR Green I作為顯色指示劑，但該熒光染料需要反應(yīng)后開蓋加入，增加了擴(kuò)增產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)。我們選用的是 NEB 公司產(chǎn)品，反應(yīng)前已經(jīng)預(yù)加入酚紅為顯色指示劑，酚紅顏色在擴(kuò)增反應(yīng)前后隨產(chǎn)物pH 值變化而變化（如在 pH 值高于8.2時(shí)為紅色，而低于6.6時(shí)為黃色），肉眼判讀結(jié)果比較直觀[11-12]。

引物組屬于檢測體系的核心組分，我們選擇新冠病毒的ORF1ab基因和N基因作為目標(biāo)檢測基因。針對新冠病毒核酸的檢測，ORF1ab基因特異度高，N基因敏感度高，單獨(dú)使用ORF1ab基因和N基因的準(zhǔn)確率分別為99%、92.3%，聯(lián)合檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率為99%[13]。通過對兩個(gè)基因的聯(lián)合檢測，N基因可以檢測到低載量的病毒，降低漏檢率，ORF1ab基因可以降低假陽性率，因而既保證了SARS-CoV-2檢測的敏感性也保證了特異性。筆者參照CDC公布的新冠病毒的ORF1ab和N基因檢測靶位附近分別設(shè)計(jì)出針對兩個(gè)基因的3套內(nèi)、外引物。從這些引物中測試、篩選出最佳的引物組。進(jìn)而設(shè)計(jì)了這些最佳引物的環(huán)引物，以縮短反應(yīng)時(shí)間，繼續(xù)篩選出最佳的環(huán)引物后，系統(tǒng)優(yōu)化、獲取了RT-LAMP檢測體系。并在特異性、最低檢測限、抗干擾能力和最佳反應(yīng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，結(jié)果與預(yù)期相符，證實(shí)了該檢測體系的可行性。

本研究所建立的新冠病毒RT-LAMP的方法依然存在一些局限性，例如檢測結(jié)果雖然可以通過顏色變化來斷定，但這種判斷具有一定主觀性，而且肉眼觀察的顏色變化的敏感性相對較差[14]，如采用熒光方法進(jìn)行檢測將明顯提升檢測的敏感性，同時(shí)采用儀器進(jìn)行檢測可避免肉眼判斷結(jié)果的主觀性，但是我們的體系是針對的是條件有限的邊境地區(qū)，因此用肉眼觀察適用性更強(qiáng)。此外，本研究建立的方法的靈敏度還不夠理想。提高靈敏度可考慮擴(kuò)大反應(yīng)體系，增加提取核酸的量、增大模板量等，但是這將增大試劑成本。

總之，筆者建立的新冠病毒RT-LAMP方法已達(dá)到了研究目的，基于此方法的高特異性，高靈敏度，低成本的特性，非常適合在條件有限的邊境地區(qū)開展利用。