C/EBPδ在結直腸癌中的表達及其對癌細胞增殖的影響

劉晶華 ，常 巍 ，余福兵 ，盛 娟 ，馮程程 ，趙霓姍

（1）云南大學附屬醫院消化內科，云南 昆明 650021；2）昆明醫科大學統計教研室，云南 昆明 650500）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的致命性疾病，環境和遺傳因素均可影響其發生風險，根據WHO的GLOBOCAN數據庫，在全球范圍內，CRC分別是男性和女性中最常見診斷的第三大和第二大癌癥，2020年新發病例190萬，死亡病例近93.5萬。男性的發病率和死亡率顯著高于女性[1]。

大多數CRC起源于腺瘤，腺瘤進展為癌，大概平均需要至少10 a[2]。其預后與臨床病理學分期密切相關，早期CRC的5 a生存率高達90%，而晚期則不足10%[3]。肝臟是CRC最常見的轉移部位，肝轉移是CRC根治性切除后死亡的主要原因[4]。

C/EBP δ由CEBPD基因編碼，是C/EBP轉錄因子家族的成員之一，它可以通過對靶細胞基因轉錄的調節，參與細胞周期調控、增殖與分化、腫瘤的發生與凋亡等重要生命活動[5]。有文獻報道其在缺氧環境下能顯著提高HIF-1α的表達，導致細胞異常增殖和腫瘤血管新生，從而促進腫瘤的進展和肝轉移[6]。而E3泛素連接酶Siah2在低氧條件下，可通過Siah2/PHD/ HIF-1α信號通路使HIF-1α蛋白聚集來調控下游基因的表達[7]。C/EBPδ與Siah2在結直腸癌中的關系及相關機制尚不明確，筆者對此進行研究，現總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取云南大學附屬醫院普通外科2017年至2018年接受結直腸癌根治術的40例患者，其中12例同時伴有肝轉移，男19例，女21例，年齡42～83歲，平均（65±13）歲。留取患者癌組織、對應的癌旁組織（踞腫瘤灶邊緣 ＜ 2 cm）以及正常腸組織（踞腫瘤灶邊緣 ＞ 5 cm），用于免疫組織化學以及免疫共沉淀檢測。所有病例均由兩名病理醫師根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）/國際抗癌聯盟（UICC）結直腸癌TNM分期系統（第七版，2010年）[8]，確定腫瘤的組織類型以及臨床病例分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅳ期12例。納入標準：所有患者均經電子結腸鏡+病理檢查確診；均表現出結腸癌的臨床特征；所有患者術前均未接受過放療、化療、生物治療等其他治療；既往無認知功能障礙；無精神類疾病。排除標準：伴有其它部位的重大疾病；伴有嚴重的肝腎功能損傷患者；病理學資料或基礎資料缺失；研究中自動退出者。存在本研究經過云南大學附屬醫院倫理委員會審核批準，并經得患者及其家屬的知情同意。

1.2 主要試劑

人結腸癌Caco-2細胞購于上海中國科學院細胞庫，MEM培養基（Gibco，美國），胰蛋白酶（碧云天，中國），DMSO（Amresco，美國），PBS（北京中杉），免疫組織化學S-P檢測試劑盒（PIERCE，美國）、ECL增強化學發光檢測試劑盒（PIERCE，美國），兔抗人C/EBPδ抗體（rockland-inc，美國），兔抗人Siah2抗體（abcam，美國），HRP標記山羊抗兔抗體（abcam，美國）。

1.3 方法

1.3.1 人結直腸腺癌細胞Caco-2培養將Caco-2細胞培養于含20%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的MEM培養基中，2 d換液1次，待細胞80% 融合度按1∶3傳代比例進行，于37 ℃，5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。

1.3.2 C/EBPδ過表達及干擾慢病毒載體構建利用全基因合成方法得到C/EBPδ的ORF序列，構建其基因表達質粒載體。將構建好的慢病毒過表達及干擾質粒載體進行超純去內毒素抽提，然后同慢病毒包裝載體共同轉染293T細胞，收集上清，純化濃縮后即為pLVX-C/EBPδ-IRESZsGreen1、pLVX-CEBPδ-RNAi慢病毒。

1.3.3 C/EBPδ過表達和干擾慢病毒感染Caco-2細胞收集Caco-2細胞，將細胞密度調至1×105/mL，每孔200 μl細胞懸液，將4 ℃保存的病毒離心20 s，慢病毒使用量=MOI×細胞數目/慢病毒滴度，將病毒液加入細胞中，加入5 μg/mL的Polybrene助轉染試劑，充分混勻后將24孔板放在37 ℃度培養箱中孵育，24 h后更換為新鮮培養基，48 h后，在熒光顯微鏡下觀察，計算慢病毒感染目的細胞的效率，余樣本留作后續實驗。

1.3.4 CCK8檢測C/EBPδ過表達和干擾對細胞增殖的影響取以上分組進行慢病毒感染后的細胞，將細胞濃度調整為1×105/mL，于96孔板上接種，每孔100 μL，每組設3個復孔，移入培養箱中培養（37 ℃，5% CO2），繼續培養72 h，每孔加入10 μL的CCK8試劑，培養箱內孵育4 h，在酶標儀上450 nm處讀取吸光度值，并繪制細胞生長曲線。

1.3.5 流式檢測C/EBPδ過表達和干擾對細胞凋亡的影響收集細胞培養基的上清和沉淀，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞3次，2 000 r/min離心5 min，收集3～5×105個細胞；在50 μL的Binding Buffer中加入5 μL 7-AAD染液，充分混勻；收集細胞后加入上述7-AAD染液；室溫下避光反應5～15 min；反應完成后再加入450 μL 的Binding Buffer混勻；再加入1 μL AnnexinV-PE充分混勻；室溫下避光反應5～15 min；1 h內，進行流式細胞儀觀察和檢測。

1.3.6 流式檢測C/EBPδ過表達和干擾對細胞周期的影響參考上述步驟，在每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢、充分重懸細胞沉淀，37 ℃條件下避光溫浴30 min，隨后4 ℃避光保存。染色完成后24 h內完成流式檢測。

1.3.7 平板克隆形成實驗檢測C/EBPδ過表達和干擾對細胞增殖的影響取正常及慢病毒感染后的細胞懸液做梯度倍數稀釋，每組細胞每皿分別接種200個細胞于含預溫培養皿中（10 mL，37 ℃），搖動使其分散均勻。于37 ℃細胞培養箱中培養2周。當出現肉眼可見的細胞克隆時，則停止培養。棄上清，PBS浸洗2次。使用結晶紫染色20 min，流動水漂洗，充分干燥，肉眼及低倍鏡下計數大于10個細胞的克隆數。

1.3.8 免疫組織化學對切片進行雙盲評價，高倍視野（×400）下選擇陽性信號最強區域計數的150個腫瘤細胞中陽性細胞數，按C/EBPδ和Siah2表達百分率分為以下四個等級：＜ 1%為0分，1%～50%為1分，51%～75%為2分，＞ 75%為3分。根據染色強度分為三個等級：淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，黃褐色計為3分。以陽性細胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分，積分 ＜ 4者判定為陰性，積分≥4為陽性。

1.3.9 免疫共沉淀用含有蛋白酶抑制劑和RNA酶抑制劑的裂解液充分裂解細胞，12 000 r/min轉速離心15 min，取上清并加入相應的抗體（兔抗人C/EBPδ抗體、兔抗人Siah2抗體）及瓊脂糖珠，在4 ℃條件下緩慢搖動4～5 h。用預冷的RIPA緩沖液洗3次，沉淀產物在SDS上樣緩沖液中100 ℃煮沸10 min，進行免疫印跡并分析。

1.3.10 Western blot檢測取結直腸癌組織裂解液上清，經電泳、轉印，5%正常小牛血清封閉，抗C/EBPδ（1∶500）、內參一抗的稀釋終濃度為1∶1 000，溫育2 h，用TBST洗3次，每次5 min，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度（1∶1 000），然后溫育2 h。ECL曝光、拍照及計算機圖像分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件，對C/EBPδ和Siah2在CRC組織中的表達及C/EBPδ在CRC中的表達與臨床病例特征的關系進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C/EBPδ和Siah2在CRC組織中的表達

免疫組織化學結果顯示，在40例結直腸癌組織中，C/EBPδ呈包膜及胞質表達陽性（圖1），陽性表達率在正常結直腸組織、癌旁組織以及癌組織分別為5%（2/40）、42.5%（17/40）和82.5%（33/40）；Siah2呈胞核表達陽性，陽性表達率分別為2.5%（1/40）、25%（10/40）和75%（30/40）（圖2）。C/EBPδ和Siah2在癌旁組織及癌組織中的陽性表達率差異無統計學意義（P＞ 0.05）；從正常組織到癌旁組織再到腸癌組織中，C/EBPδ和Siah2的陽性率逐漸升高，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），見表1。

表1 C/EBPδ與Siah2在不同組織中陽性率比較n（%）Tab.1 Comparison of positive rates of C/EBPδ and Siah2 in different tissues n（%）

圖1 免疫組化檢測CRC癌組織、對應癌旁組織和正常腸組織中C/EBPδ的表達（×400）Fig.1 Immunohistochemical detection of C/EBPδ expression in CRC cancer tissues，corresponding adjacent tissues and normal intestinal tissues

圖2 免疫組化檢測CRC癌組織、對應癌旁組織和正常腸組織中Siah2的表達（×400）Fig.2 Immunohistochemical detection of Siah2 expression in CRC cancer tissues，corresponding adjacent tissues and normal intestinal tissues

2.2 C/EBPδ在CRC中的表達與臨床病例特征的關系

C/EBPδ蛋白的表達與年齡、性別、癌胚抗原（CEA）、腫塊大小均無相關性（P＞ 0.05），與TNM分期和伴肝轉移有統計學差異（均P＜ 0.05），見表2。

表2 C/EBPδ在CRC患者癌組織中的表達與臨床病例特征的關系Tab.2 The relationship between the expression of C/EBPδ in CRC and the characteristics of clinical cases

2.3 C/EBPδ與Siah2在CRC患者癌組織中表達的相關性

從免疫共沉淀結果可見，input檢測人結腸癌細胞Caco-2 中C/EBPδ和 Siah2均有表達；IP檢測顯示C/EBPδ下拉成功，但C/EBPδ與 Siah2相互作用不明顯，見圖3。

圖3 免疫共沉淀檢測C/EBPδ與Siah2在結直腸癌組織中的表達及相互作用Fig.3 Co-immunoprecipitation to detect the expression and interaction of C/EBPδ and Siah2 in colorectal cancer

2.4 C/EBPδ過表達和干擾對細胞增殖的影響

Cell Counting Kit結果顯示，與正常對照組比較，過表達空載轉染組、干擾空載轉染組細胞增殖無明顯變化；與過表達空載轉染組比較，C/EBP δ過表達轉染組細胞增殖能力增加；與干擾空載轉染組比較，C/EBPδ干擾轉染組細胞增殖能力降低（表3）。

表3 CCK8檢測C/EBPδ過表達和干擾對細胞增殖的影響Tab.3 CCK8 detects the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell proliferation

2.5 C/EBPδ過表達和干擾對細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，與干擾空載轉染組比較，C/EBPδ干擾轉染組S期細胞比例降低；與過表達空載轉染組比較，C/EBPδ過表達轉染組S期細胞比例增加（圖4）。

圖4 流式檢測C/EBPδ過表達和干擾對細胞凋亡的影響Fig.4 Flow cytometric detection of the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell apoptosis

2.6 C/EBPδ過表達和干擾對細胞增殖的影響

平板克隆實驗顯示與干擾空載轉染組比較，C/EBPδ干擾轉染組細胞克隆形成能力降低；與過表達空載轉染組比較，C/EBPδ過表達染組細胞克隆形成能力增加（圖5）。

圖5 平板克隆形成實驗觀察C/EBPδ過表達和干擾對細胞增殖的影響Fig.5 Plate clone formation experiment to observe the effect of C/EBPδ overexpression and interference on cell proliferation

3 討論

C/EBPs是耐熱轉錄調控因子中的一種，其生物作用多種多樣，既參與正常的生理代謝過程，又與多種疾?。ㄓ绕涫茄装Y和腫瘤）的發生和發展相關，其對轉錄的調控為雙向性。C/EBPs的這種功能多樣性是與其結構的特征性相聯系的，它們屬于bZIP蛋白家族，可以和含bZIP結構的應答元件蛋白（如Fos、Jun和cAMP）結合形成同源或異源二聚體來影響細胞的變化[9]，從而極大的增加了其靶基因的多樣性。有學者研究證實：C/EBPδ缺失小鼠表現出更高ERBB2-Neu誘導的乳腺癌發生率，但肺轉移卻減少[10]，從而得出C/EBPδ做為腫瘤抑制因子和促癌轉移因子的結論。然而，筆者在前期體外實驗卻發現C/EBPδ在大腸癌細胞中呈過表達，從而推測其與結直腸癌的發生、發展呈正相關。

本研究中，C/EBPδ蛋白質在結直腸癌患者癌組織中的表達水平高于癌旁組織，提示C/EBPδ的高表達可能與結直腸癌的發生、發展有密切關系。C/EBPδ蛋白質高表達與結直腸癌的TNM分期和肝轉移呈正相關，與年齡、性別、病理分型、分化程度無關。為進一步明確C/EBPδ在結直腸癌中的功能，本研究構建了C/EBPδ過表達和干擾的結直腸癌細胞系，通過CCK8實驗、流式細胞儀檢測以及平板克隆形成實驗證實，高水平的C/EBPδ加快結直癌細胞生長、提高其增殖能力、促進癌細胞的侵襲轉移。為了深入探索C/EBPδ促進結直腸癌細胞侵襲轉移的機制，本研究同時用免疫組織化學方法檢測了結直腸癌組織中Siah2的表達，結果表明癌組織中Siah2蛋白含量較癌旁正常組織也有增加，提示二者之間存在某種聯系。C/EBPδ長期以極低量存在于各種細胞中，可被許多刺激誘導而進一步增多，例如炎性細胞因子[11]。惡性腫瘤常伴隨著大量的炎性因子[12]，因此結直腸癌組織中檢測出高表達的C/EBPδ。缺氧是促進腫瘤發生的另一個重要原因，其反應由缺氧誘導因子（HIF）所控制[13]，C/EBPδ在缺氧環境下可以促進Siah2磷酸化，HIF-1α泛素依賴蛋白酶體降解通路受阻，HIF-1α得以穩定聚集，轉入細胞核內與β亞基形成HIF-1，并與下游基因上的HRE序列結合，從而啟動效應基因的轉錄[14]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是HIF-1α最重要的靶基因之一，它可以促進腫瘤血管再生，從而影響腫瘤的進展和轉移[15]。其次，Siah2還可能通過Siah2/PHD/HIF-1α通路來調控HIF-1α的作用。常氧情況下，脯氨酰羥化酶（PHD）可以將HIF-1α降解，破壞其穩定性[16-17]。在惡性腫瘤的缺氧環境下，Siah2的表達和活性增加，其通過泛素化降解途徑促進PHD的降解，導致HIF-1α穩定性增加并且表達量增加。

本研究闡明了C/EBPδ與結直腸癌患者不良預后的關系，初步揭示了C/EBPδ在促進結直腸癌細胞侵襲轉移中的作用機制，對尋找新的結直腸癌生物標志物和基因靶點、開發潛在的治療策略、實現個體化治療具有重要意義。