全血γ-干擾素釋放試驗聯合T淋巴細胞亞群檢測在肺結核診斷中的初步應用

葛 哲 ，盧思萍 ，付仕忠 ，王春紅 ，李少瑩 ，劉 翺

（1）中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院呼吸與危重癥醫學科；2）中醫科；3）感染科；4）五華病區，云南 昆明，650032）

結核病（tuberculosis，TB）是一種由結核分枝桿菌感染引起的嚴重危害人類健康和生命的傳染病，是全球主要的公共衛生問題之一[1]。目前在結核病的防治中，最大的難題依然是結核病的診斷問題，尤其是涂陰肺結核和肺外結核的診斷[2]。

γ-干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assay，IGRA）因其檢測方便、診斷迅速、定量檢測的特點，已作為診斷結核分枝桿菌感染的輔助手段[3]，被WHO和美國疾病預防控制中心推薦[4-5]。但這種方法存在難以區分活動性結核病和潛伏性結核分枝桿菌感染的不足[6]。已有研究顯示在病原學證據不足時，IGRA聯合腫瘤標志物CA-125可明顯提高活動性肺結核的診斷準確率[7]。聯合人類白細胞分化抗原G檢測可提高IGRA診斷肺結核的特異性[8]。

研究表明，T淋巴細胞亞群參與肺結核的發生、發展[9]，肺結核患者的細胞免疫功能低下是宿主誘發感染的結核菌的原因之一。肺結核患者存在以CD4（+）T淋巴細胞亞群明顯減少為特征的淋巴細胞免疫缺陷[10]，病變越廣泛，下降越嚴重[11]。尚未見IGRA聯合外周血T淋巴細胞亞群檢測的報道。T淋巴細胞亞群檢測為肺結核患者臨床常規檢測，檢測方法較經濟簡便，筆者擬通過IGRA聯合外周血T淋巴細胞亞群檢測，探討二者聯合是否可提高肺結核的診斷效率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月至2019年6月在中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院感染科住院診斷為肺結核的所有連續患者58例，男性39例，女性19例。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）為初治痰涂陽或肺穿刺病理診斷的肺結核患者和初治痰涂陰臨床診斷為肺結核患者[2]。其中痰涂陽性患者共41例，痰涂陰性患者共17例。排除標準：（1）乙肝、丙肝病毒或HIV陽性的患者；（2）復發性肺結核患者；（3）慢性阻塞性肺病、支氣管擴張、支氣管哮喘、肺部感染、冠心病、高血壓、糖尿病、腦卒中等慢性疾病者；其他病毒性感染者；惡性腫瘤患者；肝腎功能異常者；妊娠期或哺乳期婦女；（4）3個月內使用全身糖皮質激素或其他免疫抑制劑治療。根據美國結核及呼吸協會的肺結核分類標準[12]，將肺結核分為：輕度肺結核（10例）、中度肺結核（6例）和重度肺結核（15例）。同時選擇作者單位中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院同期健康體檢的自愿者48例作為對照組。該研究獲得了中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院倫理委員會批準。所有患者參與研究前均簽署了知情同意書。

1.2 實驗材料

1.2.1 試劑（1）全血γ-干擾素釋放試驗試劑（主要試劑均來自北京萬泰生物藥業股份有限公司）：TB-IGRA酶標板，TB-IGRA測試培養管（T），TB-IGRA本底對照培養管（N），TB-IGRA陽性對照培養管（P），TB-IGRA校準品（凍干粉），TB-IGRA酶標試劑，TB-IGRA樣品稀釋液，TBIGRA校準品稀釋液，濃縮洗滌液20X，顯色劑A液，顯色劑B液，終止液，自封袋，封板膜及生理鹽水等；（2）T淋巴細胞亞群檢測試劑均由美國BD公司生產，包括CD3-PE、CD4-FITC、CD8-APC、CD16-FITC等。

1.2.2 主要設備303-O型臺式培養箱，TDZ4-WS臺式低速自動平衡離心機，DEM-3型自動洗板機，KHB ST-360酶標儀，EPICS XL流式細胞儀。

1.3 研究方法

1.3.1 全血γ-干擾素釋放試驗檢測受試者于入院第2天清晨空腹下抽取靜脈血5 mL于肝素抗凝管真空中，按照說明書分別進行抗原刺激及ELISA法血漿IFN-γ濃度測定。檢測結果根據說明書分為“陽性”、“陰性”和“不確定”。

1.3.2 T淋巴細胞亞群檢測受試者入院第2天空腹時采集靜脈血4 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管和枸櫞酸鈉促凝管中。采用流式細胞儀抗體雙標法對抗凝管中的CD4（+）T、CD8（+）T淋巴細胞亞群表達率進行測定。

1.4 統計學處理

研究數據采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，2組計量資料的比較采用t檢驗。計數資料的比較采用卡方檢驗，理論頻數小于1時使用Fisher確切概率法。采用受試者工作特征曲線分析（ROC曲線）評價不同診斷試驗（指標）對肺結核的診斷價值和診斷效能。統計學檢驗水準取0.05。

2 結果

2.1 受試者基本情況

本研究共納入肺結核患者58例，健康對照者48例，見表1。肺結核組與對照組性別分布、年齡情況差異無統計學意義（P＞ 0.05）。在痰涂陽性肺結核組和痰涂陰性肺結核組中，輕、中、重不同嚴重程度肺結核病例數總體差異無統計學意義（P＞ 0.05）。肺結核組與對照組比較，肺結核組IGRA試驗陽性例數明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。T細胞表達率經t檢驗，2組間差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

表1 受試者基線資料 [ /n（%）]Tab.1 Baseline characteristics of subjects [ /n（%）]

表1 受試者基線資料 [ /n（%）]Tab.1 Baseline characteristics of subjects [ /n（%）]

*P ＜ 0.05。

2.2 IGRA檢查結果

2.2.1 不同組別IGRA檢查結果比較痰涂陽性肺結核組和痰涂陰性肺結核組分別與對照組比較，IGRA陽性例數均高于對照組（P＜ 0.05），見表2。

表2 肺結核組和對照組IGRA結果 n（%）Tab.2 Results of IGRA in TB group and control group n（%）

2.2.2 IGRA檢測肺結核的靈敏度和特異度58例肺結核患者中，IGRA檢查診斷肺結核的靈敏度為86.2%（50/ 58），漏診率為13.8%（8/ 58）；48例健康對照者中，IGRA檢查的特異度為95.8%（46/ 48），誤診率為4.2%（2/ 48），見表3。

2.2.3 IGRA聯合T淋巴細胞亞群檢測肺結核的靈敏度和特異度IGRA檢查聯合T淋巴細胞亞群檢測診斷肺結核的靈敏度為96.6%（56/58），漏診率為3.4%（2/58）；IGRA檢查聯合T淋巴細胞亞群檢測的特異度為91.7%（44/48），誤診率為8.3%（4/48），見表4。

表4 聯合試驗檢測肺結核的四格表（n）Tab.4 The 2 × 2 table of IGRA combined with T lymphocyte subset detection of pulmonary tuberculosis（n）

IGRA 與聯合試驗靈敏度經卡方檢驗，差異具有統計學意義（Fisher確切概率法，P=0.017），聯合試驗的靈敏度96.6%高于IGRA方法的86.2%。兩種方法的特異度經卡方檢驗，差異亦具有統計學意義（Fisher確切概率法，P=0.005），聯合試驗的特異度91.7%略低于IGRA試驗的95.8%。

2.2.4 IGRA及IGRA聯合T淋巴細胞亞群檢測診斷涂陽和涂陰肺結核的ROC曲線單獨IGRA曲線下面積AUC=0.816（P=0.001），IGRA聯合T淋巴細胞亞群檢測曲線下面積AUC=0.911（P=0.000），見圖1。IGRA實驗聯合T淋巴細胞亞群檢測對涂陽或涂陰肺結核的診斷價值較高，而單一IGRA實驗診斷價值中等。

圖1 IGRA及IGRA聯合T淋巴細胞亞群檢測診斷肺結核的ROC曲線Fig.1 The ROC curve of IGRA and IGRA combined with T lymphocyte subset detection in diagnosis of pulmonary tuberculosis

3 討論

本研究通過全血γ-干擾素釋放試驗（IGRA）聯合T淋巴細胞亞群檢測，驗證其在肺結核診斷中的作用。IGRA已廣泛在臨床中得到應用，既往不同研究顯示，IGRA對活動性結核的敏感性在83%～100%之間[3,13-14]，本研究單獨IGRA的敏感性為86.2%，與既往研究基本一致。

本研究中納入研究的實驗組和對照組的男女比例、年齡均無明顯差異。肺結核患者共計58例，痰涂陽性及痰涂陰性肺結核患者病情嚴重程度分布均衡。58例肺結核患者中，50例IGRA結果陽性，8例結果陰性；48例健康受試者中，2例IGRA結果陽性，46例IGRA結果陰性。IGRA可以很好區分肺結核患者及健康對照。但仍有2例誤診，筆者進一步追蹤患者病史發現其既往有結核接觸史，據此推測，如果患者既往有結核接觸史或者有活動性結核，即使病情已經痊愈，其T細胞仍有免疫記憶，造成IGRA出現假陽性。而本研究中有5例患者漏診，主要由于該類患者的病情較嚴重，出現嚴重的免疫抑制狀態，受結核桿菌感染后的T細胞不能產生足夠γ干擾素，故不能獲得有效的統計量而出現假陰性。

結核感染后的機體內的免疫功能主要以T細胞介導的細胞免疫為主，根據其分子不同特征可分CD4（+）T細胞和CD8（+）T細胞，根據這兩種細胞亞群在機體免疫中數量多少的動態平衡對結核病的發展和轉歸起著重要影響。研究證實，肺結核患者外周血的CD4+T細胞數較正常人明顯減低[15]，同時，研究發現 CD4（+）/CD8（+）比值可作為疾病嚴重的一個重要指標，其比值下降明顯，表示疾病較重，該比值上升，表示疾病恢復[16]。本研究中，肺結核患者在治療前CD3（+）、CD4（+）T細胞及CD4（+）/CD8（+）與正常組比較明顯下降，CD8（+）T細胞較正常組升高。因此聯合外周血T淋巴細胞亞群檢測可以進一步判斷肺結核患者的病情。

如果IGRA陽性，患者臨床上需考慮活動性肺結核、陳舊性肺結核、潛伏性結核桿菌感染。通過外周血T淋巴細胞亞群檢測，如果出現CD4（+）細胞下降，CD4（+）/CD8（+）比值以及CD特別Th1細胞明顯下降，提示患者可能已經為活動性肺結核或者即將轉變為活動性肺結核，進而可以指導臨床肺結核診斷和治療。本研究通過IGRA檢測聯合T淋巴細胞亞群測定，發現對肺結核診斷的靈敏度為96.6%（56/ 58），特異度為91.7%（44/ 48），漏診率為3.4%（2/ 58），誤診率為8.3%（4/48）。靈敏度及特異度均達到90以上，漏診率也較單獨IGRA檢測（13.8%）明顯下降。IGRA實驗聯合T淋巴細胞亞群檢測ROC曲線下面積為0.911，進一步證實IGRA聯合T淋巴細胞亞群檢測與單獨IGRA檢測比較，可提高診斷的靈敏度，減少漏診率，診斷價值明顯提高。

此外，在本研究中2例健康對照出現IGRA假陽性，考慮與其陳舊性肺結核T細胞仍有免疫記憶有關，通過T淋巴細胞亞群檢測，其結果正常，可排除活動性肺結核診斷。本研究還存在一些不足：（1）本研究的樣本量較小，IGRA檢測聯合T淋巴細胞亞群測定時，漏診率增加，考慮與樣本量較小有關，但聯合檢測時靈敏度由86.2%上升至96.6%具有臨床意義，特異度雖有下降，但仍高于90%，后期可增加樣本量進一步驗證試驗結果；（2）研究為單中心研究，還需擴大研究范圍，排除人群間差異。

綜上，本研究提出的IGRA檢查聯合T淋巴細胞亞群檢測診斷肺結核具有較高靈敏度和特異性，可以明顯減少漏診率，具有較高診斷價值，值得臨床推廣，是對活動性肺結核診斷的有效補充。