紅荷山葡降脂膠囊制備工藝及含量測定方法研究

孫思琪，李 想，劉曉云，任雪陽，王 宇，董 英，馬嘉慕，宋若蘭，范琦琦，魏 靜，于啊香，王秀環(huán)，折改梅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

擬開發(fā)的紅荷山葡降脂膠囊的主要原料為紅曲、荷葉、山楂、葡萄籽提取物。方中紅曲原粉入藥，為君藥，歸脾、大腸、肝經(jīng)，可化濁降脂、活血化瘀，常用于治療痰阻血瘀所致高脂血癥，也可用于高脂血癥及動脈粥樣硬化所致的其他心腦血管疾病的輔助治療［1］，其主要調(diào)脂活性成分為他汀類化合物［2－5］。荷葉與山楂共為臣藥，荷葉歸肝、脾、胃經(jīng)，可清暑化濕、降脂［6］，具有調(diào)節(jié)血脂作用的活性成分為黃酮類化合物和生物堿類化合物［7－10］；山楂歸脾、胃、肝經(jīng)，可行氣散瘀、化濁降脂［1］，具有調(diào)血脂作用的活性成分為黃酮類化合物［11－12］。葡萄籽提取物為佐藥，主要化學(xué)成分為葡萄籽低聚原花青素，可抗氧化、抗炎、保護心血管等［13－14］，其與紅曲復(fù)配物對高血脂癥模型大鼠有明顯調(diào)脂作用［15－16］。他汀類成分是紅曲的主要調(diào)脂成分［4，17］，檢測時常以洛伐他汀作為調(diào)脂作用的指標(biāo)性成分［18］。目前，市場含紅曲的調(diào)脂類保健食品主要非法添加藥物為外源性洛伐他汀［19］。《關(guān)于以紅曲等為原料保健食品產(chǎn)品申報與審評有關(guān)事項的通知》國食藥監(jiān)許〔2010〕2號規(guī)定產(chǎn)品中總洛伐他汀每日推薦量不超過10 mg。因此，選用洛伐他汀作為紅荷山葡降脂膠囊主要質(zhì)量控制指標(biāo)最合理。荷葉與山楂共煎（水提）更有利于荷葉中有效成分的溶出，增加提取效率［20］。本課題組前期已優(yōu)化并建立了荷葉－山楂共煎提取物制備工藝與質(zhì)量控制方法，采用自制的荷葉－山楂共煎提取物，且不再對紅荷山葡降脂膠囊中的荷葉和山楂設(shè)含量測定項。葡萄籽提取物為采購原料，已依據(jù)《植物提取物 葡萄籽提取物（葡萄籽低聚原花青素）》SW/T 1－2005對原料進行含量測定，均符合標(biāo)準(zhǔn)，為合格品。本研究中擬以紅曲粉、荷葉－山楂共煎提取物和葡萄籽提取物為原料組合，采用休止角、吸濕性、樣品顏色、洛伐他汀含量、堆密度為考察指標(biāo)，篩選最佳填充劑、配比、混合時間，并確定膠囊型號及裝量，測定膠囊內(nèi)容物的臨界相對濕度；采用高效液相色譜（HPLC）法對方中君藥紅曲的指標(biāo)性成分洛伐他汀進行含量測定，為紅荷山葡降脂膠囊的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

S6000型高效液相色譜儀（北京華譜科儀科技有限公司）；BT25S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為0.01 mg）；CP224C型電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司，精度為0.1 mg）；ES－2001P型電子天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司，精度為0.01 g）；KQ－250DB型超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；ASTM－D1895型休止角測定儀（東莞奧祥儀器設(shè)備有限公司）；YG－3KG型小型干粉混合機（進杰工業(yè)設(shè)備有限公司）；X25T15型恒溫烘箱（聯(lián)泰儀器有限公司）；BJ－2型崩解時限測定儀（天津天光光學(xué)儀器有限公司）；S－400型膠囊填充板（惠普金膠囊設(shè)備有限公司）；80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩（紹興市上虞紗篩廠）。

1.2 試藥

紅曲粉（武漢佳成生物制品有限公司，批號為171123161）；山楂－荷葉提取物（自制，批號為2018001）；葡萄籽提取物（西安三江生物工程有限公司，批號為20180328）；紅荷山葡降脂膠囊（自制，批號分別為201801，201802，201803）；洛伐他汀對照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號為PRF9062041，純度為99.21%）；藥用糊精（山東聊城華陽醫(yī)藥輔料有限公司，批號為2018040102）；麥芽糊精（批號為20180426），玉米淀粉（批號為201801193），均購自秦皇島驪驊淀粉股份有限公司；預(yù)膠化淀粉（批號為180108），微晶纖維素（批號為180409），硬脂酸鎂（批號為180508），均購自安徽山河藥用輔料股份有限公司；二氧化硅（天津龍華誠信粉體技術(shù)有限公司，批號為18010889）；滑石粉（桂林桂廣滑石開發(fā)有限公司，批號為171218）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 洛伐他汀含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇－水（75∶25，V/V），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：237 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取洛伐他汀對照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為45μg/mL的溶液，即得對照品溶液。取20粒膠囊內(nèi)容物，混勻，研細，取500 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）5 min，精密量取上清液3 mL，加在中性氧化鋁柱（200～300目，4 g，內(nèi)徑為0.9 cm）上，用22 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按工藝制備不含紅曲粉的樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察［21］

專屬性試驗：分別精密吸取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品高效液相色譜相應(yīng)位置的色譜峰保留時間基本一致，陰性對照在此保留時間無色譜峰，表明其他成分不干擾洛伐他汀的含量測定，方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察與檢測限確定：將質(zhì)量濃度為180μg/mL的洛伐他汀對照品貯備液配制成質(zhì)量濃度分別為90.00，63.00，54.00，45.00，36.00，27.00，18.00，9.00μg/mL的系列對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以洛伐他汀對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y＝21 995X－4 026（R2＝1，n＝8）。結(jié)果表明，洛伐他汀對照品溶液質(zhì)量濃度在9～90μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密量取2.1.2項下對照品溶液適量，系列稀釋后進行測定，以信噪比（S/N）為3∶1時的質(zhì)量濃度為檢測限，結(jié)果檢測限為0.09μg/mL。

精密度試驗：精密吸取2.1.2項下對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.49%（n＝6），表明儀器精密度良好。

1.洛伐他汀A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖1.lovastatinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatogram of the specific test

穩(wěn)定性試驗：按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，12 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.67%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：按2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.76%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為201801）內(nèi)容物適量，精密稱定，精密加入實際含量為50%，100%，150%的洛伐他汀對照品，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果洛伐他汀的平均加樣回收率分別為103.00%，101.37%，102.29%，RSD分別為1.64%，2.72%，1.40%（n＝6），表明方法回收良好，符合要求。

2.2 制劑工藝研究

2.2.1 原料粉制備

將紅曲粉、山楂－荷葉共煎提取物和葡萄籽提取物按處方比例用混合機預(yù)混20 min。

2.2.2 輔料篩選

1）填充劑篩選

休止角測定：依據(jù)《表面活性劑 粉體和顆粒休止角的測量》GB11986－89，采用固定漏斗法測定休止角。在水平板上方75 mm處固定頸內(nèi)徑10 mm的漏斗，先將漏斗頸堵住，再倒入150 mL樣品，打開漏斗頸并讓粉體流動，用攪拌器緩慢攪拌，下方由直徑100 mm的塑料容器承接，流動停止后2 min測量粉體的錐形高度（h，mm），按ψ＝Arctan（h/50）計算錐形體的休止角（ψ），考察各處方粉的流動性。結(jié)果見表1。

表1 不同填充劑處方休止角測定結(jié)果（n＝5）Tab.1 Determination results of repose angles with different filler prescriptions（n＝5）

吸濕率測定：將稱量瓶烘至恒重，冷卻，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量，加入粉末，在底部均勻攤開，厚度為2 mm，打開瓶蓋，105℃烘5 h至恒重，取出，干燥器冷卻，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量。另將底部盛有NaCl過飽和溶液的干燥器放入25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24 h，此時恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)的相對濕度為75%，將烘至恒重的混合粉瓶放入干燥器內(nèi)，打開稱量瓶，放入干燥器上部，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保存。分別于0，2，4，6，12，24 h時稱量1次，按吸濕率（%）＝［（吸濕后混合粉質(zhì)量－吸濕前混合粉質(zhì)量）/吸濕前混合粉質(zhì)量］×100%計算各時間點的吸濕率，考察各處方粉末的吸濕性。結(jié)果見圖2。

圖2 不同填充劑處方吸濕率測定結(jié)果Fig.2 Determination results of moisture absorption percentage with different filler prescriptions

由表1可知，按粉末的流動性改善程度填充劑排序為玉米淀粉＜微晶纖維素＜麥芽糊精＜藥用糊精＜預(yù)膠化淀粉。由圖2可知，按吸濕性改善程度填充劑排序為預(yù)膠化淀粉＜玉米淀粉＜藥用糊精＜麥芽糊精＜微晶纖維素。綜合流動性和吸濕性指標(biāo)，結(jié)合成本分析，最終選定藥用糊精為本處方的填充劑。另外，不同輔料處方的休止角均大于40°，流動性差，需加入潤滑劑改善處方粉末的流動性。

2）潤滑劑篩選

結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果，以硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅為潤滑劑，按原料粉－藥用糊精－潤滑劑（44∶3∶1，m/m/m）組成處方，依法測定休止角，考察不同潤滑劑處方的流動性。結(jié)果見表2。可見，潤滑劑二氧化硅對處方流動性的改善效果最佳。

表2 不同潤滑劑處方休止角測定結(jié)果（n＝5）Tab.2 Determination results of repose angles with different lubricant prescriptions（n＝5）

3）輔料用量考察

考慮原料藥的臨床用量、山楂－荷葉共煎提取物的出膏率、處方的日服用劑量和服用次數(shù)等因素，結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果，以玉米淀粉、糊精、微晶纖維素、麥芽糊精、預(yù)膠化淀粉為填充劑，計算出所用原料與輔料的比例為11∶1（m/m）。結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果，依法測定休止角，考察不同填充劑和潤滑劑配比處方粉末的流動性，結(jié)果見表3。可見，原料粉－藥用糊精－二氧化硅（44∶1∶3，m/m/m）的平均休止角小于40°，說明該處方粉末的流動性較好，可滿足填充時對流動性的要求。

表3 不同輔料用量處方休止角測定結(jié)果（n＝5）Tab.3 Determination results of repose angles with different excipient prescriptions（n＝5）

2.2.3 處方粉末混合時間

配方原料粉與輔料按比例置混合機中，分別混合5，10，20 min，觀察混合程度，依法測定休止角。結(jié)果見表4。可見，當(dāng)粉末混合20 min時粉末色澤均勻，休止角較小。取混合20 min的樣品，按五點法取樣，即將所有樣品攤成正方形，取左上、右上、左下、右下、中間5個點，按2.1.1項下色譜條件測定洛伐他汀含量并計算RSD，以RSD≤3%為合格。結(jié)果洛伐他汀的含量分別為21.84，21.75，21.74，21.70，21.64 mg/g，RSD為0.29%。

表4 處方粉末混合時間考察結(jié)果（n＝5）Tab.4 Investigation on mixing time of prescription powder（n＝5）

2.2.4 堆密度測定和膠囊型號選擇

采用量筒法［22］測定，取處方粉末10.0 g，置50 mL量筒中，將量筒由5 cm的高度落在木板上，反復(fù)5次振動，記錄藥粉的體積。按公式堆密度＝藥粉質(zhì)量（g）/藥粉體積（mL）計算，得平均堆密度為0.46 g/mL。結(jié)合實際日服用劑量及次數(shù)，每粒裝0.34 g內(nèi)容物，得藥粉體積為0.74 mL，而0號空心膠囊容積為0.75 mL，可滿足裝量要求。故本品空心膠囊選擇0號膠囊。

2.2.5 膠囊內(nèi)容物臨界相對濕度測定

取干燥至恒重的膠囊內(nèi)容物2 g，精密稱定，置已恒重的稱量瓶中，打開瓶蓋，放入底部分別盛有MgCl2，K2CO3，NaBr，NaCl，KCl，KNO3的干燥器內(nèi)，使相對濕度分別為33%，43%，57%，75%，84%，92%，于恒溫25℃的環(huán)境中放置7 d，取出，稱定質(zhì)量，計算吸濕率。以相對濕度（X）為橫坐標(biāo)、吸濕率（Y）為縱坐標(biāo)繪制粉末的吸濕平衡曲線，得粉末的臨界相對濕度，結(jié)果見圖3。可見，其臨界相對濕度為84%。

圖3 處方粉末吸濕平衡曲線Fig.3 Moisture absorption equilibrium curve of prescription powder

2.3 成型工藝驗證

按優(yōu)化的成型工藝制備3批小試樣品（批號分別為201801，201802，201803），參照2015年版《中國藥典（四部）》［22］考察膠囊罐裝成品率、裝量差異和崩解時限，結(jié)果3批小試樣品膠囊的成品率、裝量差異和崩解時限均符合規(guī)定，說明該制劑方法穩(wěn)定可行。按2.1.1項下色譜條件，測得3批小試樣品洛伐他汀的平均含量為22.31 mg/g。

3 討論

3.1 中醫(yī)辨證

現(xiàn)代中醫(yī)理論多將高脂血癥歸屬于痰濁、眩暈、血濁、胸痹等范疇［23－24］，認為其病因病機為脂膏生于水谷，隨津液輸布全身，其病位在血脈，與肝、脾、腎三臟相關(guān)［25－27］。臨床辨證時多將病因歸于肝腎虧虛、脾虛痰濁、氣滯血瘀，為本虛標(biāo)實、虛實夾雜癥，治療原則主要為化瘀降濁、化痰健脾、滋陰養(yǎng)血、補益肝腎等［28－32］。紅荷山葡降脂膠囊方中紅曲、荷葉、山楂、葡萄籽提取物協(xié)同增效，益氣健脾，補益肝腎，清熱化痰降濁，活血化瘀通絡(luò)，標(biāo)本兼顧，輔助調(diào)脂。

3.2 制備工藝條件選擇

通過考察成型工藝不同處方的吸濕性和流動性，確定了制劑的輔料及其配比，通過測定不同混合時間下粉末的休止角和粉堆各部位中君藥紅曲指標(biāo)性成分洛伐他汀的含量，確保填充粉的均一性。本研究結(jié)果顯示，混合20 min時已完全混勻，處方粉末休止角小于40°，流動性較好，可直接填充膠囊。當(dāng)休止角接近40°，若后續(xù)放大工藝后成型困難，可對膠囊內(nèi)容物進行制粒。根據(jù)處方粉末堆密度和每日用量，選擇0號膠囊。研究結(jié)果顯示，膠囊內(nèi)容物的臨界相對濕度為84%，故在生產(chǎn)過程中建議控制相對濕度在80%以下，并對包裝材料和成品做好防潮，以免影響產(chǎn)品質(zhì)量。按優(yōu)選工藝制備3批小試樣品，其成品率、裝量差異和崩解時限均符合規(guī)定，表明該制劑成型工藝穩(wěn)定、適用、可靠。

3.3 含量測定條件選擇

采用HPLC全波長掃描法測定，結(jié)果237 nm波長下洛伐他汀的檢測靈敏度較高、峰形較好，故選擇237 nm作為檢測波長。色譜條件優(yōu)化時，考察不同柱溫（20，25，30℃）對洛伐他汀含量測定的影響，結(jié)果無明顯影響，但30℃時指標(biāo)成分的峰形較好，故柱溫選擇30℃。流動相比例優(yōu)化時，考察甲醇－水（70∶30，75∶25，80∶20，V/V）對洛伐他汀含量測定的影響，結(jié)果選用甲醇－水（75∶25，V/V）時出峰時間適中，峰形較好，洛伐他汀色譜峰與相鄰峰分離度均大于1.5。

3.4 方法評價

該制劑工藝操作簡便，工藝合理可行，可為紅荷山葡降脂膠囊保健食品的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。所建立的紅曲指標(biāo)性成分洛伐他汀含量測定方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，可用于紅山葡降脂膠囊的質(zhì)量控制。