響應(yīng)面法優(yōu)化夏枯草中總黃酮提取工藝及其抗氧化活性分析

李 鑫，赫 捷，趙 琳，薛 陽(yáng)，周文君，劉 佳

（1.遼寧省朝陽(yáng)市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 朝陽(yáng) 122000；2.遼寧省朝陽(yáng)市第二醫(yī)院，遼寧 朝陽(yáng) 122000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600）

夏枯草Prunella vulgarisL.為唇形科植物，性寒，味辛、苦，具有清泄肝火、散結(jié)消腫、清熱解毒、祛痰止咳、涼血止血功效，用于治療淋巴結(jié)核、甲狀腺腫、乳癰、急性傳染性黃疸型肝炎、細(xì)菌性痢疾等癥［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，夏枯草有較好的降血壓作用［2］，主要成分為黃酮類物質(zhì)［3］。黃酮類化合物對(duì)心血管系統(tǒng)有明顯的藥理作用，具有抗氧化、降血壓、擴(kuò)張血管、降低血管通透性、減少脆性、降低肝脂肪等作用［4］?；谥兴庂|(zhì)量標(biāo)志物（Q－Marker）的概念［5］，所測(cè)成分的藥效應(yīng)與該藥的藥理作用一致。本研究中擬對(duì)夏枯草中總黃酮提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行研究［6－9］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；CPA225D型電子天平（精度為十萬(wàn)分之一），BSA224S－CW型電子天平（精度為萬(wàn)分之一），均購(gòu)于賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；9860A型超聲波清洗器（天津市科貝爾光電技術(shù)有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

夏枯草藥材購(gòu)于安徽亳州飲片市場(chǎng)，經(jīng)遼寧省朝陽(yáng)市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心張秀麗主任中藥師鑒定為唇形科植物夏枯草的干燥果穗。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080－20181，純度為92.2%），1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH，批號(hào)為20180615），2，2′－聯(lián)氮－雙（3－乙基－苯并噻唑啉－6－磺酸）二銨鹽（ABTS，批號(hào)為20180304），均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；乙醇（色譜純，批號(hào)為20190117），維生素C（批 號(hào) 為20191202），硝 酸 鋁（分 析 純，批 號(hào) 為20161221），過(guò)硫酸鉀（分析純，批號(hào)為20160917），均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（批號(hào)為20170427），氫氧化鈉（批號(hào)為20170329），均為分析純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏枯草總黃酮含量測(cè)定（紫外分光光度法）

對(duì)照品溶液制備：取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液60 mL，超聲溶解，加50%乙醇稀釋至刻度，混勻，即得質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL的對(duì)照品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線確定：取蘆丁對(duì)照品溶液0，1，2，4，6，8，10，15 mL，分別置25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置10 min；再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置10 min；加入5 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，靜置10 min，用50%乙醇溶液稀釋至刻度。以空白試劑作為空白對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，記錄各蘆丁含量和吸光度，計(jì)算回歸方程，得Y＝0.2066X＋0.004 8（r＝0.999 6，n＝8）。結(jié)果表明，蘆丁含量在0.23～3.45 mg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

總黃酮提取量測(cè)定：分別取供試品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液4 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置10 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置10 min；加4%氫氧化鈉溶液5 mL，靜置10 min，加水定容至刻度，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

2.2 提取影響因素單因素考察

乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱取夏枯草藥材20 g，共4份，分別加入300 mL體積分?jǐn)?shù)分別為30%，50%，70%，90%的乙醇溶液，水浴加熱提取，提取2次，每次1.5 h，濾出殘?jiān)?，分別取濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，得供試品溶液。依法測(cè)定總黃酮含量，由圖1 A可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)夏枯草中總黃酮提取量最大。

料液比：稱取夏枯草藥材20 g，共4份，按液料比為20∶1（V/m），30∶1（V/m），40∶1（V/m），50∶1（V/m）分別加入50%乙醇溶液，水浴加熱提取，提取1次，提取2 h，濾出殘?jiān)謩e取1 mL，置10 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得供試品溶液。依法測(cè)定總黃酮含量，由圖1 B可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為2 h，液料比為40∶1（V/m）時(shí)，夏枯草中總黃酮提取量最高，繼續(xù)增大液料比，提取效果無(wú)明顯改善。

提取時(shí)間：稱取夏枯草藥材20 g，共5份，分別加入800 mL 50%乙醇溶液，水浴加熱提取，提取1次，分別提取2，3，4，5，6 h，濾出殘?jiān)?，? mL置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，得供試品溶液。依法測(cè)定總黃酮含量，由圖1 C可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為40∶1（V/m），提取時(shí)間為5 h時(shí)夏枯草總黃酮的提取量最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取效果不明顯。

單因素考察結(jié)果：確定了各影響因素的最佳水平，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為5 h，液料比為40∶1（V/m），初步確定了夏枯草中總黃酮的提取工藝。

2.3 提取工藝（響應(yīng)面法）

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、液料比（因素B）和提取時(shí)間（因素C）3個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素水平見(jiàn)表1。以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間為自變量，總黃酮提取量為響應(yīng)值，在提取1次的條件下，共安排17個(gè)試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)，用以估計(jì)誤差。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Factors and levels of single－factor test

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab.2 Scheme and results of test design

A.乙醇體積分?jǐn)?shù) B.液料比 C.提取時(shí)間圖1 夏枯草中總黃酮提取影響因素單因素考察A.Volume fraction of ethanol B.Liquid－solid ratio C.Extraction timeFig.1 Single－factor test of the factors affecting the extraction of total flavonoids from Prunellae Spica

模型擬合與方差分析：采用Design Expert軟件中的Box－Behnken試驗(yàn)對(duì)響應(yīng)值（總黃酮提取量）進(jìn)行二次回 歸 分 析，結(jié) 果R＝－7.470＋0.473A＋0.155B＋2.462C＋0.000 500AB＋0.006 43AC－0.001 77BC－0.005 71A2－0.001 97B2－0.257C2（R2＝0.998 4）。由表3可知，模型項(xiàng)的Pr＞F值小于0.000 1，表明該二次方程回歸極顯著，且失擬項(xiàng)Pr＞F值為0.072 9，不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可較好地描述各因素與響應(yīng)值間的真實(shí)關(guān)系。一次項(xiàng)A，B，C，二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著（P＞0.05）。因此，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程系數(shù)的估計(jì)值可知，各因素對(duì)夏枯草中總黃酮提取量的影響大小為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞液料比。在α＝0.05顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)后，可得優(yōu)化后的回歸方程R＝－7.470＋0.473A＋0.155B＋2.462C－0.005 71A2－0.001 97B2－0.257C2。

表3 模型擬合方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA for model fitting

響應(yīng)面分析：不同因素交互作用的響應(yīng)面見(jiàn)圖2。由圖2 A可知，當(dāng)提取時(shí)間為5 h時(shí)，總黃酮提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先升后降，提示料液比對(duì)提取量的影響較小。由圖2 B可知，當(dāng)液料比為40∶1時(shí)，總黃酮提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先升后降，提示提取時(shí)間對(duì)其影響較小。由圖2 C可知，總黃酮提取量隨液料比和提取時(shí)間的變化影響不大。

A.乙醇體積分?jǐn)?shù)－提取時(shí)間 B.乙醇體積分?jǐn)?shù)－液料比 C.液料比－提取時(shí)間圖2 各因素交互作用影響總提取量的響應(yīng)面和等高線圖A.Volume fraction of ethanol－extraction time B.Volume fraction of ethanol－liquid－solid ratio C.Liquid－solid ratio－extraction timeFig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the total extraction amount of total flavonoids from Prunellae Spica

2.4 提取條件優(yōu)化及驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型可預(yù)測(cè)理論，響應(yīng)值最大時(shí)的提取條件 為：A＝55.95，B＝44.34，C＝5.36，即 提 取 量 為181.307 mg，液料比44.34∶1（V/m），提取時(shí)間5.36 h?？紤]到實(shí)際操作條件，擬定夏枯草總黃酮最佳提取條件為液料比44∶1（V/m），提取時(shí)間5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%。以此提取條件檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法建立回歸模型的正確性，測(cè)得總黃酮的提取量為173.341 mg，與理論預(yù)測(cè)值相比，差異不顯著。提示該回歸模型與實(shí)際情況擬合很好，響應(yīng)面法可用于對(duì)夏枯草總黃酮提取條件進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.5 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除率測(cè)定：取總黃酮提取液和維生素C，分別配制質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的供試品溶液和陽(yáng)性對(duì)照溶液，分別取1.0 mL，加入1.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，混勻，室溫下充分反應(yīng)30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率。DPPH自由基清除率（%）＝（1－Ai/A0）×100%。式中，A0表示DPPH溶液的吸收值；Ai表示樣品與DPPH混合液的吸收值［10－11］。

ABTS＋·自由基清除率測(cè)定：取總黃酮提取液和維生素C，分別配制成質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的供試品溶液和陽(yáng)性對(duì)照溶液，分別取0.8 mL，精密量取稀釋后的ABTS＋·貯備液1.2 mL，混勻，靜置5 min，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按公式計(jì)算自由基清除率。

抗氧化活性分析：結(jié)果見(jiàn)圖3?？傸S酮質(zhì)量濃度在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照溶液及夏枯草總黃酮提取物質(zhì)量濃度隨著DDPH和ABTS＋·自由基清除率的增加而增加。在清除DPPH自由基試驗(yàn)中，其半數(shù)清除質(zhì)量濃度（IC50）和最大清除率分別為0.042 mg/mL和70%，維生素C分別為0.085 mg/mL和84%；在清除ABTS＋·自由基試驗(yàn)中，其IC50和最大清除率分別為0.074 mg/mL和82%，維生素C分別為0.048 mg/mL和90%。結(jié)果顯示，夏枯草總黃酮提取物對(duì)DPPH和ABTS＋·自由基均有良好的清除效果，但不如維生素C。

A.DPPH自由基 B.ABTS＋·自由基圖3 夏枯草中總黃酮提取物對(duì)DPPH和ABTS＋·自由基的清除效果A.DPPH free radical B.ABTS＋·free radicalFig.3 Scavenging effect of total flavonoids from Prunellae Spica on DPPH and ABTS＋·free radicals

3 討論

3.1 統(tǒng)計(jì)方法選擇

現(xiàn)有文獻(xiàn)中關(guān)于夏枯草提取總黃酮的條件優(yōu)化研究多采用的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法為正交設(shè)計(jì)法，其可同時(shí)考慮多種因素，并通過(guò)較少的試驗(yàn)次數(shù)得到最佳因素水平組合，但不能在給定的連續(xù)區(qū)域內(nèi)找到因素和響應(yīng)值的對(duì)應(yīng)關(guān)系（回歸方程）。但響應(yīng)面分析法試驗(yàn)次數(shù)少，周期短，求回歸方程精度高，可滿足其不足。

3.2 回歸方程

在單因素考察結(jié)果基礎(chǔ)上，以夏枯草總黃酮提取量為響應(yīng)值，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design－Expert，采用Box－Behnken試驗(yàn)原理建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、液料比和提取時(shí)間（h）與總黃酮提取量間的二次回歸模型，回歸模型擬合程度好，能真實(shí)反映各影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，得到各因素對(duì)響應(yīng)值影響的順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞液料比。

3.3 單因素考察和響應(yīng)面考察優(yōu)缺點(diǎn)

首先采用單因素考察法確定影響因素變量的大概最優(yōu)范圍，作為響應(yīng)面的零水平點(diǎn)，可減少響應(yīng)面試驗(yàn)所做的試驗(yàn)數(shù)量，主要選取影響提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)影響較大的獨(dú)立因素進(jìn)行優(yōu)化。單因素考察僅單獨(dú)考察某個(gè)因素的影響，在實(shí)際試驗(yàn)中要綜合考慮各因素間的干擾影響，故需要選擇較全面的響應(yīng)面考察法，優(yōu)選樣品提取的最佳工藝。

3.4 抗氧化活性

在篩選夏枯草中總黃酮最佳提取工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)夏枯草中總黃酮抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)夏枯草中總黃酮對(duì)DPPH自由基和ABTS＋·自由基均有良好的清除作用，可為夏枯草的生物活性研究提供理論依據(jù)。