金葉子二萜類化學成分高效液相色譜－蒸發光散射檢測法指紋圖譜研究*

閔莎位，劉云斌，李 倩，萬近福，胡建林△

（1.昆明醫科大學藥學院·云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650500；3.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111）

金葉子Craibiodendron yunnaneseW.W.Smith為杜鵑花科金葉子屬的一種常綠小喬木，除滇東北外，云南全省均有分布，味澀、微辛，性溫，有劇毒，具有發表溫經、活絡止痛功效［1］。有大毒，葉水煎劑內服后，會出現視力模糊，嘔吐，手腳麻木，神智昏迷；酒精浸提液內服可導致四肢無力和昏睡。小鼠腹腔注射0.05～1.0 g/kg金葉子葉的水煎劑可出現腹部收縮，弓背，仰頭，活動減少，甚至驚厥死亡［1］；根有顯著降低腎上腺內維生素C的作用，全株有麻醉作用［2］。金葉子作為民間用藥多用于治療跌打損傷、風濕麻木、外感風寒，以及骨折、癱瘓和胃痛，并在西南地區用作殺蟲劑歷史悠久［2］。同時，金葉子還為云南省藥物研究所研發的具有消腫鎮痛、活血化瘀功效的復方藥腫痛氣霧劑的重要原料藥之一［3］。文獻［2－16］研究顯示，金葉子含有多種二萜、三萜、黃酮和其他類化合物等，其中木藜蘆烷型四環二萜是最重要的活性成分，也是有毒成分［1］。中藥化學成分的多樣性與復雜性是其發揮療效的物質基礎，但同時也是其質量評價的重點與難點［17］。指紋圖譜分析可實現多元檢測與多水平評價，是國際公認的控制中藥、天然藥質量的有效方法［18］。為了進一步提高金葉子藥材質量的可控性，本研究中建立了金葉子藥材二萜類化學成分的高效液相色譜－蒸發光散射檢測（HPLC－ELSD）法指紋圖譜，并通過相似度評價對11批不同批次藥材進行分析。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ME204型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.001 g）；Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），配有ELSD檢測儀；HH－6型智能數顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器預先責任公司）；YF－150型高速中藥材粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；Hel－VapValue Digital型小型旋轉蒸發儀（德國海爾道夫公司）；層析柱（安徽韋斯實驗設備有限公司，規格為16 mm×28 mm）。

1.2 試藥

金葉子葉（產地為昆明市團結鄉，批號分別為20180816－1＜S1＞，20180816－2＜S2＞，20180816－3＜S3＞，20180816－4＜S4＞，20180816－5＜S5＞，20180816－6＜S6＞，20211205－1＜S7＞，20211205－2＜S8＞，20211205－3＜S9＞，20211205－4＜S10＞，20180801＜S11＞）；craiobioside B對照品（純度為98%），grayanoside B對照品（純度為93%），grayanoside C對照品（純度為93%），paniculosideⅣ對照品（純度為95%）均由本實驗室分離鑒定；HPD－100，D 101，AB－8，D－941型樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；柱色譜硅膠（80～100目、200～300目），薄層色譜硅膠G板，均購于青島海洋化工有限公司；高純水由Mili－Q純水制備系統制備；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；三氯甲烷（工業純重蒸），甲醇（批號為20170822），95%乙醇（批號為20201003），均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫（0～60 min時95%A→65%A）；流速：1.0 mL/min；ELSD檢測器參數：漂移管溫度為50℃，氣體壓力為25 psi，增益為500；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.2 溶液制備

取craiobioside B對照品、grayanoside B對照品、grayanoside C對照品、paniculosideⅣ對照品各適量，精密稱定，分 別 加 甲醇制成每1 mL含0.190，0.144，0.206，0.206 mg的對照品溶液。取金葉子藥材粉末2 g，精密稱定，加75%乙醇100 mL，加熱回流提取30 min，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，濾過，濾液上于已平衡好的D－941型陰離子交換樹脂（內徑為2.0 mm，柱高為60 mm），用20%乙醇60 mL洗脫，棄去洗脫液，用80%乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干燥，殘渣加甲醇10 mL溶解，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察［19］

精密度試驗：取藥材粉末2 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以grayanoside B為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于2%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20180816－1）藥材粉末2 g，其6份，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以grayanoside B為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于2%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于5%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，3，6，9，12，15 h時進樣測定，記錄色譜圖，以grayanoside B為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于2%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于5%（n＝6），表明供試品溶液在15 h內穩定。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

指紋圖譜測定：取上述11批金葉子藥材粉末各2 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2.0版）”分析、評價測定結果，應用中位數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.10，匹配方法為多點校正。11批金葉子二萜類化學成分指紋圖譜見圖1。

圖1 11批金葉子二萜類化學成分指紋重疊圖譜Fig.1 Superimposed fingerprints of diterpenoids from 11 batches of Craibiodendrin Yunnanesnsis Folium

參照峰確定：11批樣品均在60 min內出峰，grayanoside B（峰4）保留時間適中，分離度良好，故選擇grayanoside B為金葉子樣品的參照峰。結果見圖2。

圖2 參照物grayanoside B色譜圖Fig.2 Chromatogram of reference material grayanoside B

共有峰確定：11批樣品中，有8個峰的保留時間基本一致，選擇這8個峰作為指紋圖譜共有峰。以grayanoside B（峰4）為參照峰，分別計算8個共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果見表1和表2。

表1 指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab.1 Relative retention time of common peaks in fingerprints

表2 指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab.2 Relative peak area of common peaks in fingerprints

2.5 特征指紋圖譜分析

將11批樣品的指紋圖譜導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2.0版）”，以批號為20180816－1（S1）樣品的二萜類化學成分指紋圖譜為對照譜圖，得到11批樣品指紋圖譜與該對照圖譜的相似度。結果11批（S1—S11）樣品所含二萜類化學成分的相似 度 均 較 高，分 別 為0.926，0.991，0.999，0.994，0.998，0.993，0.998，0.998，0.999，0.994，0.999。

2.6 共有峰分離及其結構鑒定

2.6.1 共有峰分離

取金葉子藥材葉部分10kg，75%乙醇以液料比15∶10（V/m）分別加熱回流提取30 min，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，濾過，濾液上于已平衡好的D－941型陰離子交換樹脂（內徑為8 cm，柱高為60 cm），用20%乙醇10 L洗脫，棄去洗脫液，再用80%乙醇10 L洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干燥，得到浸膏500 g。95%乙醇溶解，600 g硅膠拌樣。粗分劃段，試藥用硅膠柱色譜［甲醇－三氯甲烷（100∶1～10∶1）］梯度洗脫，得到目標峰化合物含量較高的G，H，J組分。G組分經中壓反相（Rp）C18柱（10%～60%乙醇，V/V）洗脫，得到1個亞組分，經重結晶、濾過結晶、收集母液再重結晶，得JR04（0.2 g）；H組分經中壓Rp C18柱（10%～30%乙醇）洗脫，得到2個亞組分，再分別重結晶、濾過結晶、收集母液再重結晶，得JR02（0.5 g）、JR03（1.0 g）；J組分經中壓Rp C18柱（10%～40%乙醇）洗脫，得到1個亞組分，經重結晶、濾過結晶、收集母液再重結晶，得化合物JR03（0.5 g）。

2.6.2 共有峰結構鑒定

JR01，白色無定形粉末（甲醇）。（＋）－ESI－MSm/z：537［M＋Na］＋，分子式 為C26H42O10。1H－NMR（400 MHz，C5D5N）δH：5.51（1H，s），5.39（1H，s），4.96（1H，dd，J＝4.4，8.3 Hz），4.33（1H，d，J＝4.4 Hz），4.02（1H，d，J＝10.5 Hz），3.33（1H，dd，J＝13.8，10.5 Hz），3.12（1H，d，J＝8.3 Hz），2.35（1H，dd，J＝4.0，10.9 Hz），2.30（1H，br.s），2.30（1H，d，J＝4.7 Hz），2.18（1H，d，J＝10.9 Hz），2.08（1H，d，J＝14.0 Hz），1.97（1H，d，J＝13.8 Hz），1.93（1H，s），1.90（1H，m），1.86（1H，d，J＝14.0 Hz），1.82（1H，m），1.68（1H，m），1.68（1H，m），1.56（1H，s），1.56（1H，s），1.35（1H，s）。13C－NMR（125 MHz，C5D5N）δC：67.9（C－1），73.1（C－2），92.6（C－3），49.4（C－4），85.7（C－5），71.5（C－6），48.8（C－7），45.9（C－8），55.7（C－9），152.4（C－10），26.9（C－11），26.8（C－12），50.0（C－13），35.9（C－14），57.4（C－15），80.0（C－16），25（C－17），23.2（C－18），21.5（C－19），110.2（C－20），104.7（Glc－1），75.4（Glc－2），78.8（Glc－3），71.8（Glc－4），79（Glc－5），62.8（Glc－6）。經過與文獻比對，以上數據與文獻［2］報道基本一致，故化合物鑒定為craiobioside B，其結構見圖3 A。

A.Craiobioside B B.Grayanoside B C.Grayanoside C D.PaniculosideⅣ圖3 化合物結構圖A.Craiobioside B B.Grayanoside B C.Grayanoside C D.PaniculosideⅣFig.3 Structure of the Compounds

JR02，白色無定形粉末（甲醇）。（＋）－ESI－MSm/z：521［M＋Na］＋，分子式為：C26H42O9。1H－NMR（400 MHz，C5D5N）δH：5.08（1H，d，J＝7.7 Hz），4.10－4.68（8H，m），2.69（1H，t，J＝6.2 Hz），1.87（3H，s），1.62（3H，s），1.39（3H，s）。13C－NMR（100 MHz，CD3OD）。δc：43.4（C－1），37.9（C－2），88.9（C－3），50.9（C－4），82.7（C－5），72（C－6），46.8（C－7），44.7（C－8），54.5（C－9），152（C－10），24.1（C－11），26.6（C－12），47.9（C－13），36（C－14），63.2（C－15），79.7（C－16），27.3（C－17），25.9（C－18），20.4（C－19），113.1（C－20），105.8（Glc－1），75.8（Glc－2），78.8（Glc－3），71.9（Glc－4），78.6（Glc－5），63.1（Glc－6）。經過與文獻比對，以上數據與文獻［20］報道基本一致，故化合物鑒定為grayanoside B，其結構見圖3 B。

JR03，白色無定形粉末（甲醇）。（＋）－ESI－MSm/z：521［M＋Na］＋，分子式為：C26H42O9。1H－NMR（125 MHz，C5D5N）δH：5.26（1H，s），4.88（1H，d，J＝7 Hz），3.8－4.5（many protons），1.70（3H，s），1.50（3H，s），1.17（3H，s）。13C－NMR（125 MHz，C5D5N）δc：59.3（C－1），35.4（C－2），92.2（C－3），51.7（C－4），86.3（C－5），71.4（C－6），49（C－7），45.9（C－8），55.5（C－9），154.2（C－10），26.8（C－11），26.9（C－12），49.8（C－13），35.8（C－14），57.5（C－15），78.7（C－16），24.9（C－17），23.5（C－18），21.1（C－19），110.4（C－20），105.2（Glc－1），75.9（Glc－2），78.8（Glc－3），71.9（Glc－4），78.8（Glc－5），63（Glc－6）。經過與文獻比對，以上數據與文獻［21］報道基本一致，故化合物鑒定為grayanoside C，其結構見圖3 C。

JR04，白色無定形粉末（甲醇）。（＋）－ESI－MSm/z：521［M＋Na］＋，分子式為：C26H42O9。1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δH：5.40（1H，d，J＝7.9 Hz），1.21（3H，s），0.97（3H，s）。13C－NMR（100 MHz，C5D5N）δc：40.9（C－1），19.5（C－2），38.5（C－3），44.2（C－4），57.5（C－5），22.5（C－6），43.8（C－7），44.9（C－8），56.3（C－9），40.1（C－10），19（C－11），26.7（C－12），45.9（C－13），37.6（C－14），53.7（C－15），81.7（C－16），66.5（C－17），28.6（C－18），176.9（C－19），15.9（C－20），95.8（Glc－1），74.1（Glc－2），79.3（Glc－3），71.2（Glc－4），79.3（Glc－5），62.2（Glc－6）。經過與文獻比對，以上數據與文獻［22］報道基本一致，故化合物鑒定為paniculosideⅣ，其結構見圖3 D。

2.7 特征峰歸屬和確定

通過供試品與對照品對照定位分析，鑒定了4個主要特征峰，分別為craiobioside B（峰2）、grayanoside B（峰4）、grayanoside C（峰6）、PaniculosideⅣ（峰8）。各色譜峰保留時間及歸屬見表3，色譜圖見圖4。

表3 指紋圖譜共有峰的歸屬Tab.4 Attribution of common peaks in fingerprints

3 討論

3.1 色譜條件選擇

A.供試品溶液 B.Craiobioside B對照品溶液 C.Grayanoside B對照品溶液 D.Grayanoside C對照品溶液E.PaniculosideⅣ對照品溶液圖4 高效液相色譜圖A.Test solution B.Reference Solution of craioside B C.Reference solution of grayanoside B D.Reference solution of grayanoside C E.Reference solution of paniculosideⅣFig.4 HPLC chromatograms

曾考察甲醇－水、乙腈－水洗脫系統，結果乙腈－水洗脫系統的分辨率高、峰形好。曾考察紫外檢測器和ELSD檢測器，結果紫外檢測器條件下噪聲嚴重，二萜類化合物吸收較小或無吸收，干擾較強，不適用于金葉子中二萜類化學成分的指紋圖譜研究；采用ELSD檢測器進行檢測，色譜圖信息較清晰，可全面反映樣品的真實情況。故確定檢測器為ELSD檢測器。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

曾考察提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、甲醇和50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇）、提取方式（超聲提取與回流提取）、提取時間（30，60，120 min）、液料比［10∶1（V/m），20∶1（V/m），50∶1（V/m），100∶1（V/m）］等提取條件，以grayanoside B的峰面積和峰形作為判斷依據。結果用50倍75%乙醇作為溶劑回流提取30 min效果最佳。采用HPD－100，D 101，AB－8，D－941型樹脂對金葉子原藥材提取液中二萜類化學成分進行富集，并以grayanoside B的峰面積和峰形為判斷依據。結果D－941型樹脂對金葉子中二萜類化學成分的富集效果較好，色譜峰較豐富，峰形較好。故確定富集材料為D－941型陰離子交換樹脂。

3.3 指紋圖譜相似度評價

對11批金葉子藥材二萜類化學成分進行指紋圖譜相似度評價，確定了11批藥材的8個共有色譜峰。由圖1可知，8個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.2%，相對穩定；但相對峰面積的RSD在19%～44%范圍內，表明不同批次、不同采收時間段的樣品質量存在一定差異，11批金葉子藥材間所含二萜類化學成分基本相同，但各成分的相對含量有差異。

3.4 共有峰分離和指認

采用硅膠、RP硅膠C18柱等方法對特征圖譜共有峰中的化合物進行分離，應用質譜、核磁共振等方法進行結構鑒定；通過與文獻比對，確定化合物的結構，并通過參照各對照品的保留時間等色譜行為，對共有峰進行歸屬和指認。共分離得到4個共有峰的化學成分，并進行了結構鑒定及指認，其他二萜類化學成分還有待進一步深入研究。

3.5 方法評價

本方法精密度高，重復性好，穩定可靠，反映了金葉子中二萜類化學成分指紋圖譜的概況，可為金葉子的整體質量控制提供有效方法，為金葉子藥材質量的控制和評價提供參考。