在渝流通雙黃連口服液質量分析

余 為

（重慶市黔江食品藥品檢驗所，重慶 409000）

雙黃連口服液由金銀花（雙花）、黃芩、連翹經現代工藝加工制成，具有疏風解表、清熱解毒等功效，主要用于治療外感風熱所致感冒、甲型H1N1流感、重癥急性呼吸綜合征、流行性腮腺炎、口腔潰瘍等［1－5］。2020年起，雙黃連因被發現口服后可通過多靶點、多通路抑制新型冠狀病毒［6－8］而熱銷。本研究中對35批在渝流通雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸、連翹苷3個指標性成分進行檢測，以為臨床應用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；XP205型分析天平（美國Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；SB－800DT型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號為110715－201318，含量為93.3%），綠原酸對照品（批號為110753－201415，含量為96.2%），連翹苷對照品（批號為110821－201615，含量為94.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；冰醋酸、中性氧化鋁均為分析純；水為超純水。35批雙黃連口服液（見表1）均為2017年起就在重慶流通且送監督抽檢的產品，被抽檢單位主要來自重慶轄區的醫院、診所、藥品批發公司、連鎖藥店、個體藥店等。

表1 35份雙黃連口服液樣品信息Tabl.1 Information of 35 samples of Shuanghuanglian Oral Liquid

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SR－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：黃芩為甲醇－水－冰醋酸（50∶50∶1，V/V/V），金銀花為甲醇－水－冰醋酸（20∶80∶1，V/V/V），連翹為乙腈－水（25∶75，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：黃芩為274 nm，金銀花為324 nm，連翹為278nm；柱溫：25℃；進樣量：黃芩為5μL，金銀花、連翹均為10μL。

2.1.2 溶液制備

黃芩：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解，制成質量濃度為0.1 mg/mL的黃芩苷對照品溶液。精密量取樣品1 mL，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋，超聲（功率800 W，頻率40 kHz）處理20 min，放至室溫，用50%甲醇定容，即得黃芩供試品溶液。按雙黃連口服液工藝及處方制備缺黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

金銀花：取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加水溶解，制成質量濃度為40μg/mL的綠原酸對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加水定容，搖勻，即得金銀花供試品溶液。按雙黃連口服液工藝及處方制備缺金銀花的陰性樣品，并按供試品制備方法制備陰性對照品溶液。

連翹：取連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇，制成質量濃度為60μg/mL的連翹苷對照品溶液。精密量取樣品1 mL，過中性氧化鋁柱（100～120目，6 g，內徑為1 cm），用70%乙醇40 mL洗脫，然后濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解后轉移至5 mL容量瓶中，再用50%甲醇定容，搖勻，即得連翹供試品溶液。按雙黃連口服液工藝及處方制備缺連翹的陰性樣品，并按供試品制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.1.2項下3種對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果各測定組分能與相鄰組分完全分離，理論板數均大于5 000。色譜圖見圖1。

1.黃芩苷 2.綠原酸 3.連翹苷A，D，G.對照品溶液（分別為黃芩苷、綠原酸、連翹苷） B，E，H.供試品溶液C，F，I.陰性對照品溶液（分別缺黃芩、金銀花、連翹）圖1 高效液相色譜圖1.baicalin 2.chlorogenic acid 3.forsythinA.D，G.Reference solution（baicalin，chlorogenic acid and forsythin respectively）B.E，H.Test solution C.F，I.Negative reference solution（without Scutellariae Radix，Lonicerae Japonicae Flos and Forsythiae Fructus respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.1.2項下3種對照品溶液各2，5，10，15，20μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以各對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，黃芩苷為Y1＝6.033 4X1＋56.51，r＝0.999 1（n＝5）；綠原酸為Y2＝35.095X2－120.83，r＝0.999 5（n＝5）；連翹苷為Y3＝5.882 6X3＋42.476，r＝0.999 8（n＝5）。結果表明，黃芩苷、綠原酸、連翹苷質量濃度分別在40.77～407.68μg/mL、8.70～87.02μg/mL、12.65～126.48μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.1.2項下各對照品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果黃芩、金銀花、連翹峰面積的RSD分別為0.35%，0.21%，0.40%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為16112611）適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，10，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果黃芩、金銀花、連翹峰面積的RSD分別為0.93%，0.86%，1.02%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為16112611）適量，共6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果黃芩、金銀花、連翹含量的RSD分別為1.57%，1.33%，1.86%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為16112611），共6份，分別加入一定質量濃度對照品溶液，依法制備供試品溶液，并按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n＝6）

2.1.4 樣品含量測定

取35批樣品各適量，依法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表3。3個指標性成分的含量均高于2020年版《中國藥典》標準，說明2017年起在渝流通雙黃連口服液質量較好。產品內在質量差異較大，同一廠家、不同批號含量高低值相差也較大。詳見表4。

表3 不同廠家樣品指標性成分含量、相對密度及pH（n＝3）Tab.3 The content，relative density and pH of index components in the samples from different manufacturers（n＝3）

表4 相同廠家不同批號樣品指標性成分含量、相對密度及pHTab.4 The content，relative density and pH of index components in different batches of samples from the same manufacturer

2.2 相對密度及pH

參照2020年版《中國藥典（一部）》中方法檢測，結果35份樣品的相對密度為1.13～1.16，pH為5.30～6.19，均較穩定。詳見表4。

2.3 樣品聚類分析

采用SPSS 23.0統計學軟件對35批樣品進行聚類分析［9］，以各有效成分作為指標。結果可將樣品聚為三類。其中，編號4，7，10－16，18－21，23，25，32，34樣品聚為一類；編號1－3，5，9，17，24，26－30，33，35聚為一類；編號6，8，22，31聚為一類。詳見圖2。需注意，哈藥集團三精制藥股份有限公司及河南福森藥業有限公司均有相同批號的2份樣品分別聚在不同類，表明即使同一廠家相同批次的樣品，內在質量依然存在較大差異。

圖2 聚類分析結果Fig.2 Results of cluster analysis

3 討論

程敏等［10］發現，山銀花提取物偽品或摻偽品中綠原酸含量相對較高。2020年版《中國藥典（一部）》規定綠原酸含量為0.60 mg/mL，35批樣品中綠原酸含量最高達1.60 mg/mL，是否直接添加了某提取物有待考證，應考慮廠家是否按藥品生產質量管理規范（GMP）要求生產，是否本著節約成本的原則核算金銀花投料，可參照山銀花特征圖譜灰氈毛忍冬皂苷乙、指紋圖譜進行考察［11］。研究表明，產地、采收季節及烘干方式均影響連翹苷的含量。如王琳等［12］等發現，連翹質量以河北產最優，其次為山西產，再次為河南產；青翹優于老翹；6月采收最優；采后汽蒸烘干處理較自然晾曬能更好地保存藥用成分。劉廷等［13］采用超高效液相色譜串聯質譜法測定雙黃連口服液中6個酚酸類成分、3個苯乙醇苷類成分、8個黃酮類成分，故認為找出提取物特征圖譜與原藥材差異有利于從源頭控制成藥質量。

雙黃連口服液臨床應用較廣，其功效的發揮與其內在質量緊密相關，綠原酸新批次含量幾乎均高于舊批次，原因可能由于綠原酸為苯丙酸類，分子結構有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩定部分，在儲存中易水解等異構化造成含量降低。查閱文獻［14－15］可知，不同的純化工藝、精制等環節的處理方法對綠原酸含量均有影響。為了提供質優、穩定的雙黃連口服液，廠家需從黃芩、金銀花、連翹的源頭控制，嚴格執行GMP生產、流通環節的質量監管，以更好提高其品質。

綜上所述，本研究中以黃芩苷、綠原酸、連翹苷的含量作為指標進行檢測與分析，發現目前在渝流通雙黃連口服液質量較好，但不同廠家、不同批號的雙黃連口服液含量差異較大，需從藥材源頭、生產、流通等各環節對質量進行把控，以提高雙黃連口服液質量的一致性。