湖北恩施土家族藥物豆板還陽中3種成分含量測定研究*

張萬濤，鄭 露，涂 星

（1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000；3.風濕病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；4.湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

豆板還陽為苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔Lysionotus pauciflorusMaxim.的干燥地上部分，又稱石吊蘭、石豇豆、巖澤蘭、石澤蘭、巖豇豆、巖石茶等，是土家族“七十二還陽”藥物之一，收載于2020年版《中國藥典（一部）》，含量測定以石吊蘭素為指標成分，具有化痰止咳、軟堅散結功效，用于治療咳嗽痰多、瘰疬痰核［1－3］。其主要含有黃酮類、揮發油類、植物甾醇和三萜皂苷類、苯丙素苷類等多種成分［4－7］，具有抗結核、抗炎、降壓、止咳化痰、清除自由基、抗粥樣動脈硬化、抗腫瘤等作用［8－10］。文獻［11－14］中對貴州、云南等地區的石吊蘭進行了含量測定與研究，但少見湖北恩施土家族豆板還陽的相關報道。本研究中建立了湖北省恩施8個產地豆板還陽藥材中阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素含量的高效液相色譜（HPLC）法，并比較了不同產地的含量差異，為土家族藥物豆板還陽藥用資源的開發、利用和保護提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2030C型液相色譜儀（日本島津公司），配有二極管陣列（PDA）檢測器；VS－100UE型恒溫超聲提取儀（無錫沃信儀器制造有限公司）；BT－25S型電子分析天平（精度為0.01 mg），BSA224S－CW型電子分析天平（精度為0.1 mg），均購自德國賽多利斯公司；MilliQ型超純水系統（貝徠美生物科技有限公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號為110773－201614，含量為99.0%），槲皮素對照品（批號為100081－201610，含量為99.1%），石吊蘭素對照品（批號為111555－200602，含量為98.1%），均為色譜純，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司）；水為去離子超純水，其余試劑均為分析純。豆板還陽藥材采自湖北恩施不同地區，采集方式均為野外采集，去雜質，曬干，經湖北民族大學醫學部朱敏英副教授鑒定為正品。樣品來源信息見表1。

表1 湖北恩施豆板還陽樣品來源信息Tab.1 Source information of Lysionoti Herba in the Enshi City，Hubei Province

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：島津InertSustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min時15%A，25～55 min時15%A→52%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：332 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

1.阿魏酸 2.槲皮素 3.石吊蘭素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.ferulic acid 2.quercetin 3.lysionotinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素對照品各10 mg，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，分別加75%甲醇，制成質量濃度為100μg/mL的溶液，搖勻，即得對照品貯備液。取粉碎后的樣品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為240 W，頻率為45 kHz）20 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2項下阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素對照品貯備液，加入75%甲醇，稀釋為系列質量濃度的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。以對照品溶液的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，并計算回歸方程。結果見表2。

表2 3種成分線性關系考察結果（n＝6）Tab.2 Results of the linear relation test of three components（n＝6）

精密度試驗：取2.2項下對照品貯備液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，測定峰面積。結果阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素峰面積的RSD分別為0.45%，0.47%，0.17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（編號為S7），精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，18，24 h時進樣測定。結果阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素峰面積的RSD分別為2.01%，1.82%，2.30%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（編號為S7）精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素峰面積的RSD分別為1.73%，1.51%，0.91%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（編號為S7）1 g，精密稱定，共6份，按與已知成分含量1∶1（m/m）的比例分別加入阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素對照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取不同產地的豆板還陽藥材，分別制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，以峰面積計算豆板還陽中3種成分的含量。結果見表4。

表4 不同產地豆板還陽中3種成分含量測定結果（%，n＝3）Tab.4 Determination results of three components in Lysionoti Herba in different producing areas（%，n＝3）

2.5 聚類分析

將8個不同產地的豆板還陽藥材含量測定結果導入SPSS 21.0統計學軟件，采用聚類方法選擇組間聯接，區間采用平方Euclidean距離，得到8個不同產地的藥材聚類分析樹狀圖，詳見圖2。可見，當距離（d）為8時，可分為三類，即鶴峰縣走馬鎮（S8）單獨聚為Ⅰ類，利川市建南鎮（S5）、建始縣花坪鄉（S6）、宣恩縣椿木營鄉（S3）聚為Ⅱ類，宣恩縣長潭河鄉（S1）、宣恩縣七姊妹山（S2）、咸豐縣高樂山鎮（S4）、宣恩縣高羅鎮（S7）聚為Ⅲ類。

圖2 8個不同產地的藥材聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of medicinal materials from eight different producing areas

3 討論

3.1 測定條件選擇

檢測波長：本研究中所用的PDA檢測器可實現多波長同步分析，經等高線圖與光譜圖分析后得出，石吊蘭素最大吸收波長為332 nm，與2020年版《中國藥典（一部）》中石吊蘭項下檢測波長一致，槲皮素與阿魏酸在該波長下也有較強吸收，故選擇332 nm作為檢測波長。

流動相：根據文獻［2，13－16］，選擇不同流動相［乙腈－0.05%磷酸、甲醇－1%醋酸（梯度洗脫），甲醇－1%醋酸（85∶15，V/V）、甲醇－水（68∶32，V/V）、甲醇－0.05%磷酸（68∶32，V/V）］，通過考察并綜合試驗成本、操作方法簡便性等，最終選擇乙腈－0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測時長較短，峰形較好，與雜質峰分離度較好。

色 譜 柱：最初選擇InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），試驗發現所有色譜峰均拖尾，經推測可能是由色譜柱柱頭污染導致。換用新的Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），所有色譜峰拖尾消失，但檢測時間較長，與InertSustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）比較后，最終選擇InertSustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）。

3.2 聚類分析結果指導產地藥用資源開發與利用

對恩施地區8個產地豆板還陽藥材中3種成分的含量測定后發現，各產地間成分差異較大，只有咸豐縣高樂山鎮（S4）、宣恩縣高羅鎮（S7）、鶴峰縣走馬鎮（S8）的樣品中同時檢測出阿魏酸、槲皮素、石吊蘭素3種成分，且阿魏酸、槲皮素含量均較低，8個產地豆板還陽中石吊蘭素的含量均達到2020年版《中國藥典（一部）》要求的1～3倍。結合含量測定及聚類分析結果，恩施地區的豆板還陽以鶴峰縣走馬鎮所產為佳，可為豆板還陽藥用資源的開發、利用和保護提供參考。

3.4 方法評價

2020年版《中國藥典》中以石吊蘭素為指標性成分控制豆板還陽的藥材質量，質控指標單一。中藥的成分復雜多樣，功效多種多樣，故多成分含量測定的質控指標較單一成分能更好地反映藥材質量［17－19］。本研究中首次建立了同時測定豆板還陽中3種成分含量的HPLC法，并比較了不同產地3種成分的含量差異，可為提高現行質量標準和全面控制豆板還陽藥材質量提供參考。值得注意的是，編號為S1，S2，S3，S5豆板還陽樣品中幾乎沒有測出槲皮素，編號為S3，S5，S6豆板還陽樣品中幾乎沒有測出阿魏酸；尤其是S3和S5，既不含阿魏酸，也不含槲皮素。因此，將阿魏酸和槲皮素作為豆板還陽藥材定量分析的指標性成分還值得商榷。導致產地間成分差異的原因復雜多樣，有可能與樣品的生長環境、年限、采收時間、采收后的加工貯存、檢驗檢測方法等因素有關，還有待進一步研究。