超高效液相色譜－串聯質譜法檢測風痛安膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ*

劉東升，楊平榮，姚世霞，賀軍權，朱旭江△

（1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；2.國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

風痛安膠囊由防己、通草、桂枝等12種中藥組方，用于濕熱阻絡所致痹病，癥見關節紅腫熱痛、肌肉酸楚，是治療急、慢性風濕性關節炎的非處方藥［1］，現行質量標準為2020年版《中國藥典（一部）》中的相關標準。防己為防己科植物粉防己Stephania tetrandraS.Moore的干燥根，主要有效成分為粉防己堿、去甲基粉防己堿、輪環藤酚堿、防己諾林堿等，具有利水消腫、祛風止痛之功效［2］。其來源復雜，品種較多，且各地用藥習慣不同，造成同物異名或同名異物，藥農誤采或有意混采等諸多原因造成市場上經常出現以同屬植物的根冒充防己，或用馬兜鈴科植物的根或莖與防己混用現象，與正品防己的功效、主治相差較大［3－5］，尤其是用馬兜鈴科防己（漢中防己、廣防己、宜賓防己、冕寧防己）代替防己藥材進行投料時易造成用藥安全問題。馬兜鈴科植物中含馬兜鈴酸類物質馬兜鈴酸（AAs）和馬兜鈴內酰胺（ALs），具有腎毒性、致癌和致基因突變作用［6－8］，含馬兜鈴酸類物質的藥用植物和制劑因此被多數國家禁用，我國先后取消了關木通、廣防己和青木香的藥用標準，并要求含馬兜鈴、尋骨風、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑嚴格按處方藥管理。目前，馬兜鈴酸類物質含量較低的中藥或植物藥仍在使用。本研究中采用液質聯用法［9－16］對風痛安膠囊中可能存在的馬兜鈴酸Ⅰ進行研究，發現部分生產企業生產的風痛安膠囊樣品中檢出馬兜鈴酸Ⅰ。依據原國家食品藥品監督管理局藥品補充檢驗方法研制指南、2020年版《中國藥典（一部）》中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢查方法及相關文獻報道，并結合樣品特點，建立了測定風痛安膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ含量的超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS－8045型三重四極桿液質聯用儀（日本島津公司）；TQ5500型三重四極桿液質聯用儀（AB SCIEX）；Waters e2695液相色譜儀（美國沃特世公司）；ME204型分析天平（精度為0.01 mg），MS205DU型分析天平（精度為0.01 mg），均購于梅特勒－托利多公司；KQ－500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；10～1 000μL Eppendorf加樣槍（德國艾本德公司，規格為10，100μL）。

1.2 試藥

馬兜鈴酸Ⅰ對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110746－201611，含量為98.9%）；乙腈、甲酸、甲酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。2018年馬兜鈴酸國家專項抽驗中共7家企業、23批風痛安膠囊樣品，其批號和生產廠家見表1。

表1 樣品批號及生產廠家信息Tab.1 The batch number of samples and the information of manufacturers

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Shim pack GIST HP C18柱（100 mm×2.1 mm，3.0μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨）（B），梯度洗脫（0～15 min時35%A～40%A，15～28 min時40%A～65%A，28～30 min時65%A～95%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：2μL。

2.1.2 質譜條件

電噴霧離子源：正離子掃描，多反應監測模式；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化氣壓力：30 psi；源電壓：4 000 V；保留時間：16 min；定量離子：母離子質荷比（m/z）359.0，子離子m/z298.0；定性離子：子離子m/z296.0。

2.2 溶液制備

取馬兜鈴酸Ⅰ對照品適量，加甲醇制成每1 mL含100μg的溶液，作為馬兜鈴酸Ⅰ對照品貯備液。取樣品1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定質量，超聲提取（功率為250 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷至室溫后用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方及工藝制備缺防己藥材的陰性樣品，取1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液（基質溶液）。取含廣防己的風痛安膠囊內容物1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備陽性樣品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：選擇m/z359.0→298.0和359.0→296.0作為馬兜鈴酸Ⅰ檢測離子對進行測定。結果在陽性樣品溶液色譜中，與馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液色譜相應保留時間均呈現離子流色譜峰；而陰性樣品溶液色譜中，在與馬兜鈴酸Ⅰ對照品色譜相應保留時間均無相應離子流色譜峰。可見，樣品中其他藥味對測定無干擾。馬兜鈴酸Ⅰ對照品、陰性樣品和陽性樣品溶液的典型離子色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取2.3項下對照品貯備液適量，用甲醇和基質溶液分別稀釋成0.047 6，0.237 8，0.475 5，0.951 0，1.902 0，3.804 1μg/mL系列對照品溶液，依法進樣測定。以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝1 448 364.136X－152 512.526，r＝0.999 8（n＝6），結果表明，馬兜鈴酸Ⅰ質量濃度在0.047 6～3.804 1μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一批樣品（廠家E，批號為170101），依法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，重復進樣6次。結果馬兜鈴酸Ⅰ峰面積的RSD為1.32%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批樣品（廠家E，批號為170101），依法制備供試品溶液，室溫下放置0，6，12，16，20，24 h時分別進樣測定。結果馬兜鈴酸Ⅰ峰面積的RSD為2.94%（n＝6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

1.m/z 359.0→298.0 2.m/z 359.0→296.0A.陰性樣品溶液 B.對照品溶液 C.陽性樣品溶液圖1 離子色譜圖1.m/z 359.0→298.0 2.m/z 359.0→296.0A.Negative sample solution B.Reference solution C.Positive sample solutionFig.1 Ion chromatograms

重復性試驗：取同一批樣品（廠家E，批號為170101），依法制備供試品溶液，共6份，按2.1項下色譜條件測定，并計算樣品中待測成分的含量。結果馬兜鈴酸Ⅰ含量的RSD為2.23%（n＝6），表明方法重復性良好。

回收試驗：精密量取線性關系考察項下對照品溶液（質量濃度為3.804 1μg/mL）2.5 mL，置具塞錐形瓶中，氮氣吹干，取已知含量的樣品（廠家E，批號為170301）0.5 g，精密稱定，平行6份，制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定含量，并計算回收率。結果平均回收率為99.14%，RSD為1.97%（n＝6）。

儀器及方法檢測限確定：以線性關系考察項下溶液圖譜計算信噪比（S/N）為3時的儀器檢測限為1.98 ng/mL。取陰性樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定質量濃度馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液1 mL，精密加入70%甲醇24 mL，稱定質量。超聲提取40 min，放冷至室溫，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續濾液，即得。進樣測定，以S/N為3∶1時確定檢測限為1.98 ng/mL，故本品方法檢測限為2 pg。

耐用性試驗：取同一批樣品（廠家E，批號為170101），依法制備供試品溶液，在其他色譜條件不變的情況下，分別采用島津LCMS－8045型和AB SCIEX TQ－5500型三重四極桿液質聯用儀測定馬兜鈴酸Ⅰ的含量。結果的RSD為2.31%，表明不同儀器對結果的影響較小。

2.4 樣品含量測定

按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下液相色譜與質譜條件進樣測定。結果廠家B（批號為160101）、廠家D（批號為20150901）、廠家E（批號為170101和170301）中檢出馬兜鈴酸Ⅰ的含量分別為17.40，14.53，24.70，19.63μg/mL。

3 討論

3.1 檢測方法選擇

參照中國藥典和文獻［14］，采用高效液相色譜（HPLC）法測定樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的含量。結果部分樣品檢出與馬兜鈴酸Ⅰ對照品相應保留時間的色譜峰，且紫外吸收光譜與馬兜鈴酸Ⅰ對照品一致（采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內進行紫外吸收光譜掃描，馬兜鈴酸Ⅰ對照品分別于389，318，250，223 nm波長處有吸收峰）。進一步試驗發現，采用HPLC法對樣品中的馬兜鈴酸Ⅰ進行含量測定，方法回收率低于50%。分析原因可能是，處方成分復雜，且馬兜鈴酸Ⅰ含量較低，在樣品提取和濃縮過程中鹽酸、三氯甲烷等易制毒試劑使用量較大。故采用樣品前處理簡單且測定過程不易受干擾的UPLC－MS/MS法測定樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的含量。

3.2 基質效應考察

UPLC－MS/MS中，樣品中的基質受待測成分電離的影響，測定結果發生一定變化。為了進一步考察樣品基質對測定結果的影響，分別以相應質量濃度的風痛安膠囊陰性樣品基質溶液和甲醇配制相應的對照品溶液進行比較，通過考察線性關系，發現風痛安膠囊陰性樣品基質對待測成分的電離響應值影響不明顯，故忽略基質效應的影響，直接以甲醇為溶劑進行對照品溶液制備和線性關系考察。

3.3 檢測離子對選擇

考察文獻［9－16］和前期預試驗，顯示多采用正離子、多反應監測模式，以乙腈－0.1%甲酸（含5 mmol/L甲酸銨）溶液為流動相，母離子以m/z359.0為主，子離 子 有m/z298.0，m/z296.0，m/z324.0，m/z268.0等。但碎片離子m/z298.0豐度最強，其次為碎片離子m/z296.0，故最終選擇質譜檢測器，電噴霧正離子模式，進行多反應監測，選擇m/z359.0→298.0為定量離子、m/z359.0→296.0為定性離子。

3.4 風險控制

參照2020年版《中國藥典（一部）》中與馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢查相關的方法，結合樣品特點，采用液－質聯用法建立的風痛安膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的檢查方法，對7家企業23批風痛安膠囊樣品中馬兜鈴酸Ⅰ進行檢查，其中3家企業4批樣品中檢出馬兜鈴酸Ⅰ，檢出率為17.39%。說明該品種的中藥存在含有馬兜鈴酸類成分的馬兜鈴科防己（宜賓防己、廣防己、冕寧防己、漢中防己）替代或摻偽防己藥材生產風痛安膠囊的風險，提示企業應加大原藥材的控制，杜絕此類問題的發生。該方法的建立，為進一步查清相關產品的質量狀況提供了基礎數據和方法依據。