阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠超聲心功能指標(biāo)與核因子κB p65表達(dá)水平關(guān)系

李 新，白 雪，李 娜

(1.銅川市人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科， 陜西 銅川 727000；2.安康市中心醫(yī)院超聲科，陜西 安康725000； 3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061)

心臟損傷在臨床上比較常見(jiàn)，多指心肌損害后繼發(fā)的心臟大小、結(jié)構(gòu)、形狀的任何改變，病理特征表現(xiàn)為病理性心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積[1-2]。除了外傷導(dǎo)致外，心臟損傷發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，涉及到諸多信號(hào)途徑的參與。核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，可對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生極強(qiáng)的敏感性，NF-κB p65表達(dá)升高可促使機(jī)體產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡[3-4]。有研究顯示NF-κB p65可借助基因表達(dá)產(chǎn)生如血管舒張等作用，參與了慢性心力衰竭的病理生理過(guò)程[5]。阿霉素屬蒽環(huán)類抗生素，阿霉素能引起氧自由基的形成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的核或核膜產(chǎn)生直接攻擊，從而廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療中[6]。但是阿霉素在抗腫瘤的同時(shí)對(duì)正常的組織器官也有一定的毒性作用，在一定程度上可產(chǎn)生心肌毒性作用，且與劑量高度相關(guān)，可使得機(jī)體出現(xiàn)心臟增大、心功能降低、心肌間質(zhì)纖維化等表現(xiàn)[7]。超聲心動(dòng)圖是臨床上常用的檢查機(jī)體心功能的重要方法之一，具有直觀、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)與無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，特別是高頻超聲更加具有高分辨率、低穿透性等優(yōu)點(diǎn)，從而能有效評(píng)價(jià)心臟的收縮與舒張功能[8-9]。本文具體探討了阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠的超聲心功能指標(biāo)與NF-κB p65表達(dá)水平的關(guān)系，以明確超聲應(yīng)用的價(jià)值與心臟損傷發(fā)生的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究材料 清潔級(jí)雄性健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠72只購(gòu)自江蘇菱菲生物科技公司，體重220～250 g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SCXK2984821。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只左右，自由飲水，自由食用飼料，動(dòng)物房溫度與濕度保持在25 ℃與50%左右。阿霉素(鹽酸阿霉素)購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，抗NF-κB p65抗體購(gòu)自bioworld公司，抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自博士德公司，丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，3%戊巴比妥鈉溶液安徽購(gòu)自上海生工公司。超聲診斷儀購(gòu)自Philips公司(IE33)，探頭頻率12 MHz，配偶圖像采集工作站。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠分組與建模：將大鼠隨機(jī)平分為三組：對(duì)照組、模型A組、模型B組，三組分別給予腹腔注射0、1、5 ml/kg阿霉素，每周3次，連續(xù)2周。

1.2.2 觀察指標(biāo)：在造模第1周與第2周每組各處死12只大鼠，進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè)與記錄。①大鼠麻醉后取左側(cè)臥位，超聲設(shè)置探查角度為15°～30°，深度為2～3 cm，經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插入左心室，記錄左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)與左室短軸縮短率(LVFS)等指標(biāo)。②摘取大鼠的心臟，心臟剪成1 mm3大小碎塊，1 g/L胰酶和0.3 g/L膠原酶進(jìn)行消化，1000 r/min下4 ℃離心5 min，取上清，檢測(cè)MDA含量及SOD活性。③取心臟的心肌組織，置10%中性甲醛緩沖液固定，制成病理切片后進(jìn)行常規(guī)蘇木精伊紅染色，鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。④取心臟的心肌組織，用細(xì)胞裂解液裂解得到蛋白，根據(jù)15 μg與15 μl體積進(jìn)行上樣，進(jìn)行蛋白雜交分析，一抗為稀釋后的NF-κB p65(1∶1000)，β-actin(1∶2000)，曝光后用Image軟件半定量分析條帶灰度，相對(duì)表達(dá)量以各樣本與β-actin條帶灰度比值計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)心臟參數(shù)比較 模型A組、模型B組造模第1周與第2周的LVSP與LVEDP值高于對(duì)照組(均P<0.05)，LVEF與LVFS值低于對(duì)照組(均P<0.05)，模型A組與模型B組對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)心臟參數(shù)比較

2.2 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)MDA含量及SOD活性比較 模型A組、模型B組造模第1周與第2周的SOD活性低于對(duì)照組(均P<0.05)，MDA含量高于對(duì)照組(P<0.05)，模型A組與模型B組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)MDA含量及SOD活性比較

2.3 三組心肌HE染色情況對(duì)比 模型A組、模型B組：心肌呈典型心肌病樣改變，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維扭曲腫脹，胞外間隙增寬。對(duì)照組：心肌纖維排列整齊，細(xì)胞間隙正常。

2.4 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 模型A組、模型B組造模第1周與第2周的NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，模型B組低于模型A組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.5 阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠超聲心功能指標(biāo)與NF-κB p65表達(dá)水平相關(guān)性分析 在模型B組中，造模第2周的NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平與LVSP、LVEDP、LVEF、LVFS都存在相關(guān)性(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠超聲心功能指標(biāo)與NF-κB p65表達(dá)水平相關(guān)性分析

3 討 論

阿霉素是一種廣譜抗腫瘤抗生素，具有較強(qiáng)的劑量依賴性心臟毒性，可導(dǎo)致相關(guān)心肌病，能夠成功誘導(dǎo)出大鼠心臟損傷模型。同時(shí)阿霉素的誘變性和心臟毒性部分相關(guān)，為此應(yīng)用抗氧化劑可以減輕阿霉素對(duì)心肌的損傷[10]。隨著基礎(chǔ)研究的深入，超聲心動(dòng)圖已廣泛應(yīng)用于評(píng)定機(jī)體的心肌缺血、心肌梗死時(shí)局部及整體心功能變化情況，具有價(jià)廉、無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。特別是當(dāng)前高頻超聲具有更高的時(shí)間分辨力，通過(guò)調(diào)節(jié)掃描角度、取樣深度從而獲得不同心肌節(jié)段整個(gè)心動(dòng)周期的運(yùn)動(dòng)信息，從而更全面地評(píng)價(jià)心臟狀況[11-12]。本研究顯示模型A組、模型B組造模第1周與第2周的LVSP與LVEDP值高于對(duì)照組(均P<0.05)，LVEF與LVFS值低于對(duì)照組(均P<0.05)，模型A組與模型B組對(duì)比差異也都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠成功。目前認(rèn)為阿霉素的心臟毒性與其抗腫瘤活性無(wú)關(guān)，主要與氧自由基損傷、鈣超載等因素存在相關(guān)性，抗氧化劑可減輕阿霉素的心臟毒性作用[13]。本研究顯示模型A組、模型B組造模第1周與第2周的SOD活性低于對(duì)照組(均P<0.05)，MDA含量高于對(duì)照組(P<0.05)，模型A組與模型B組對(duì)比差異也都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從機(jī)制上分析，含量高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，也是膜脂質(zhì)過(guò)氧化重的要產(chǎn)物[14]。SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶，也可反映機(jī)體內(nèi)源性清除超氧陰離子及過(guò)氧化氫的能力[15]。阿霉素對(duì)心臟的急性毒性作用主要表現(xiàn)為心肌炎、擴(kuò)張性心肌病、充血性心力衰竭、心律失常等，阿霉素可導(dǎo)致大鼠心肌氧化損傷，從而使得SOD活性降低與MDA含量增加[16]。

NF-κB p65是氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)器，在機(jī)體通過(guò)刺激炎癥和氧化應(yīng)激在介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生與發(fā)展。抑制NF-κB p65的表達(dá)可能會(huì)限制炎癥和氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)，也是預(yù)防動(dòng)脈老化的重要靶基因[17]。下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)能夠通過(guò)調(diào)控炎癥、凋亡、纖維化等，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示模型A組、模型B組造模第1周與第2周的NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)，模型B組低于模型A組(P<0.05)，表明阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型可導(dǎo)致NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加。當(dāng)前也有研究表明抑制NF-κB p65表達(dá)可緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激作用，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞硝基酪氨酸和NADPH氧化酶表達(dá)，減輕對(duì)血管內(nèi)皮的損傷作用[18-19]。

本研究采用的高頻超聲探頭具有穿透力弱、分辨力高等特點(diǎn)，能獲得大鼠清晰的左室長(zhǎng)軸切面及心尖四腔心切面圖像，從而可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)大鼠心臟的收縮與舒張功能[20-21]。本研究顯示阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠的超聲心功能指標(biāo)與NF-κB p65表達(dá)水平存在相關(guān)性(P<0.05)。從機(jī)制上分析，阿霉素在體內(nèi)還原為半醌，與心肌的親和力高，發(fā)生氧化反應(yīng)后生成自由基，使得心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的損害及細(xì)胞損傷，改變細(xì)胞膜的通透性，使得細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而導(dǎo)致NF-κB p65表達(dá)水平降低[22]。

總之，阿霉素誘導(dǎo)心臟損傷模型大鼠多伴隨有超聲心功能指標(biāo)的異常與NF-κB p65表達(dá)水平下降，兩者存在相關(guān)性。