基于PDMS微結構的氣道平滑肌舒張藥物評測裝置*

高薔， 王龍飛， 鄧林紅， 王翔

(常州大學生物醫學工程與健康科學研究院，常州 213164)

1 引 言

哮喘是一種以氣道高反應性和氣道壁重構為特征的慢性阻塞性氣道疾病。雖然其發病機理尚不清楚[1]，但已有研究表明作為氣道壁的重要組成部分，氣道平滑肌細胞(ASMC)是哮喘發生時導致氣道狹窄的主要效應細胞。ASMC的異常收縮增加了氣道內部的機械應力，使氣道狹窄[2]。因此，ASMC是治療哮喘的主要靶細胞[2-4]。臨床上舒張ASMC的藥物主要包括β2受體激動劑、糖皮質激素、膽堿受體拮抗劑等[3,5-7]。例如，鹽酸異丙腎上腺素(ISO，一種β2受體激動劑)通過與ASMC的β2受體結合，引發ASMC產生cAMP信號分子，進而導致ASMC松弛[8-10]。然而，此類藥物具有導致心律失常、低氧血癥等副作用，長期使用還會導致ASMC的舒張能力下降，使哮喘進一步惡化。因此，篩選新一代的靶向氣道平滑肌的舒張藥物非常重要，而如何準確、快速測量藥物的細胞舒張效應是評價藥物有效性的關鍵。

目前已建立了從動物到細胞水平的多種用于評價ASMC舒張藥物的方法[11]。動物模型雖然對藥物作用產生完整生理反應，卻無法用于對ASMC的收縮狀態的直接測量[12-13]。組織切片法保留了體內的部分真實結構，可用于直接觀測ASMC的收縮狀態。但是，源自動物的組織無法真實反映藥物對人體組織的作用[14]。2D體外細胞培養技術可以培養人源平滑肌細胞，但由于缺少可能調節平滑肌力學響應的胞外基質，無法較好地模擬體內的生化和物理環境[15-16]。因此，通過3D細胞培養構建微組織部分模擬體內環境的技術更具優勢[14]。這些培養在小培養皿中的微組織由細胞和基質(如膠原蛋白、纖連蛋白等)共同構成[17-23]。遺憾的是人們僅能從其收縮面積的變化來間接判斷藥物的作用，無法獲得平滑肌的力學測量數據[16]。因此，如何準確地測量藥物處理前后微組織的收縮力仍是一個挑戰。

本研究設計并制備了一種基于PDMS微結構的細胞力學傳感器，利用3D細胞培養在其表面構建ASMC微組織。實驗表明，培養在PDMS微結構上的ASMC和膠原混合物能自發較快地收縮，48h后形成力學穩定的微組織。通過測量微弦的彈性系數和間距可以計算出ASMC微組織的收縮力。對微組織進行藥物處理并測量了微組織的收縮和舒張力的變化，結果顯示，該檢測裝置具有較高的靈敏度和可靠性。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

Sylgard 184(美國Dow Corning公司)；三氯(1H,1H,2H,2H—全氟辛基)硅烷(美國Sigma公司)；聚乙烯醇(PVA)、組胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鼠尾I型膠原(美國Advanced Biomatrix公司)；杜氏改良培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶(美國gibco公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海凌風化學試劑有限公司)；細胞松弛素D(美國Sigma 公司)；硅脂(美國Baysilone公司)；鹽酸異丙腎上腺素(ISO)(上海源葉生物科技有限公司)。

CO2細胞培養箱(日本三洋公司)；生物安全柜(BSC-1300ⅡA2，蘇州安泰空氣技術有限公司)；超級純水儀(Milli Q Plus，Integral 10，美國Millipore公司)；倒置顯微鏡(Primo Vert)、倒置熒光顯微鏡(cell observer)、激光共聚焦顯微鏡(LSM 710)(德國Zeiss公司)；體視顯微鏡(S8APO，德國Leica公司；等離子清洗機(Potentlube PT-5S，深圳三和波達機電科技有限公司)。

2.2 方法

2.2.1PDMS微弦的制備 首先將Sylgard 184和交聯劑以10:1 比例混合并澆筑在硅模具上，高溫固化后得到聚二甲基硅氧烷(PDMS)負模。再將PDMS負模表面涂布2%PVA的脫模劑。將PDMS預聚物加入負模的微槽內80℃固化4 h(1∶10 PDMS)后，微槽兩端位置粘合兩個2 mm高的PDMS矩形支持塊。兩個支持塊通過等離子處理，鍵合于一個14 mm圓形蓋玻片上。將裝置浸泡在水中過夜后，剝離反模得到PDMS微弦結構。最后將微弦裝置放置于24孔培養皿中備用。

2.2.2PDMS微絲彈性系數的測量 首先將待測微弦水平放置于精密天平上。利用微操懸臂上裝載的不銹鋼針頭對微弦中央位置施加垂直載荷。以20 μm為步進距離，分別記錄微操懸臂下降距離和相應的天平讀數。通過重力加速度常數將質量(mg)轉換為力(mN)，得到微弦載荷-形變曲線，其斜率即為微弦的彈性系數(k)。

2.2.3細胞培養和藥物處理 本研究采用參考文獻[6]原代提取的大鼠氣道平滑肌細胞(8-10代)培養于含10%胎牛血清的低糖DMEM中，置于37℃、5% CO2培養箱。I型膠原蛋白首先經pH中性調解后，再與一定數量的細胞混合，得到終濃度為106個細胞/mL和2 mg/mL膠原蛋白的混合物。4℃條件下，將細胞膠原混合物(6 μL)滴加于微弦中央位置，37℃培養箱30 min固化后，再向培養板孔中加入1 mL培養基，然后置于培養箱或顯微鏡下進行長期成像。

為進行藥物處理實驗，微組織培養48 h后，將培養基換成無血清培養基并孵育12 h。藥物梯度實驗時，每40 min由低到高依次向培養孔中加入100 μL含藥物的預熱培養。

2.2.4微組織的相差與熒光成像 倒置熒光顯微鏡的多點成像載物臺可同時對24孔板內的多個微組織目標進行長時自動成像。顯微鏡的環境維持系統可維持37℃，5%CO2濃度的細胞培養環境。使用5×/0.16NA物鏡和ORCA-Flash4.0相機(日本濱松)進行相差成像(30 min/幀)。

采用Calcein-AM/ PI雙染色試劑盒檢測微組織內細胞存活。藥物處理后，微組織經2 M Calcein-AM和1 μM PI在黑暗中孵育15 min。更換為新鮮培養基后，用Zeiss 710 共聚焦顯微鏡于20×/0.5NA物鏡下分別在綠色(488 nm)和紅色(570 nm)通道對微組織成像。

2.2.5細胞收縮和舒張力的計算及圖像分析 使用Image J測量兩微弦中間位置之間的像素距離并根據相機的參像素數換算為距離單位。微組織的力(F)根據微弦位移距離(D)和彈性系數(k)計算：F=kD。微組織內細胞的矢量遷移分析通過ImageJ中的粒子圖像測速(PIV)插件進行分析，并得到相對應的圖像。使用GraphPad Prism 6進行t檢驗，P<0.05即認為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 PDMS微弦的表征

本研究采用PDMS微弦結構作為細胞的應力傳感器。我們首先對由模具灌注成型的微弦進行了形態和力學表征。

由圖1(a)可知，掃描電鏡圖像顯示微弦表面光滑，平行且均勻。測量不同批次制備的結構的寬度、間距和高度，結果表明不同批次的微絲尺寸無顯著性差異，見圖1(b)。PDMS聚合物是良好的彈性材料，微米尺度的PDMS結構可在微牛級作用力下發生形變。微弦擾度變化與受力載荷呈線性關系，見圖1(c)。因此，根據胡克定律，我們計算得出該PDMS微弦結構的彈性系數為0.05 μN/μm。

圖1 PDMS微弦的表征

3.2 微組織的形成及其收縮力測量

當細胞-膠原混合物加載到微弦中央部位后，膠原在37℃環境中固化。隨培養時間延長，該混合物在細胞的作用下持續收縮成一個橢球狀微組織，見圖2(a)。我們利用粒子圖像測速分析方法來跟蹤微組織內細胞的運動軌跡，發現微組織周邊的細胞比中央部分的細胞的遷移速度更快，其速度在第10 h達到最高，超過0.5 μm/min，見圖2(b)。

微組織的收縮導致2根微弦的間距逐漸減小。根據測量的微弦間距和其彈性系數，計算得出該過程中微組織的收縮力的變化。由圖2(c)可知，密度為106個細胞/mL的微組織經30h培養后，其收縮力區域穩定，并達到約9 μN。但微組織含有較低密度的細胞時(105個細胞/mL)，其收縮力顯著下降，最高值約為2 μN。為測量較為明顯的舒張作用，本研究將采用含高密度細胞的微組織進行藥物實驗。

圖2 ASMC微組織在PDMS微結構上

3.3 藥物誘導微組織在PDMS微結構上發生變化

為模擬哮喘中ASMC的異常收縮態，本研究利用組胺來刺激微組織收縮。由圖3(a)可知，與未經組胺處理的對照組相比，微組織經100μM組胺處理30min后的收縮力增大了8倍。隨后，本研究通過細胞松弛素D解除肌動蛋白細胞骨架張力來確定ASMC微組織的可舒張的范圍。10 μM細胞松弛素 D處理30 min可大幅削弱ASMC的收縮力，見圖3(b)。該結果證明在微結構上構建的微組織可以測量0.04～0.20 μN間的力學變化。為評測該測量范圍內舒張藥物的效果，本研究使用臨床藥物ISO來處理微結構上的ASMC微組織。由圖3(c)可知，處于收縮態的微組織(組胺處理組)對1μM ISO更為敏感。而對照組在100 μM ISO處理時才產生較大幅度的舒張。進一步的實驗表明，兩組樣品均在500 μM ISO處理時產生最大舒張力。通過對藥物處理后微組織進行細胞存活檢測，我們發現高濃度ISO處理并未導致細胞死亡,見圖3(d)，證明其舒張作用不是由于細胞死亡引發。值得注意的是，當藥物濃度進一步增大到2 mM后，其舒張作用削弱，見圖3(c)。高濃度ISO舒張作用下降的機制還有待進一步研究。

圖3 ASMC微組織用于梯度加舒張藥物實驗

4 討論

本研究設計并制備了一種簡單的細胞力學測量裝置，并在其上面成功地構建了細胞微組織。利用PDMS微結構檢測出臨床藥物ISO的有效濃度范圍，當ISO藥物濃度達到2 mM以上，其促舒張作用下降，提示用藥濃度不能過高。本研究還發現模擬哮喘中處于收縮態的平滑肌微組織對ISO更為敏感，說明ISO對哮喘中的平滑肌細胞具有一定的特異性舒張作用。綜上，本研究建立的檢測細胞力學和藥物評測的方法，能實時定量檢測到藥物導致的細胞收縮力的變化，可靈敏、方便地篩選出抗哮喘藥物。