堿提酸沉法提取漢麻籽蛋白粉的優化

石杰，宋淑敏，魏連會，楊慶麗，董艷，姬妍茹

黑龍江省科學院大慶分院（大慶 163319）

漢麻（Cannabis SativaL.）是我國麻類產業研發的主導作物，也是近年來我國麻類產業進程中發展最快的產業。漢麻種子的開發利用不僅對漢麻產業發展有著重要作用，同時也為人們提供一種具有豐富營養和保健價值的食物資源，關于漢麻籽保健食品的研究與開發成為產業熱點之一。有研究表明漢麻籽是一種十分優異的蛋白來源，不含大豆寡聚糖和致敏因子，并且可以促進人體產生膠原蛋白，不會造成胃脹、反胃和過敏反應[1]。漢麻籽蛋白的分離方法主要有減提酸沉、水酶法、反膠束和膜分離法以及高壓均質法。其中，水酶法的成本較高，部分蛋白質在提取過程中會被改性[2]，反膠束和膜分離法是一種較新的分離方法，生產的蛋白粉雖然純度較高，但設備較貴，產率較低，操作復雜[3-4]，而高壓均質法不但提取率低且雜質率高[5]。因此，可用于批量生產漢麻蛋白的主要是堿提酸沉法，但仍需要探索和優化提取條件以提高漢麻蛋白產率。通過單因素試驗和正交試驗確定和優化脫脂漢麻粕提取漢麻籽蛋白的方法，以獲得高純度的漢麻籽蛋白粉。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂漢麻粕（錦州俏牌生物技術有限公司）。

石油醚、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸、硫酸、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純試劑）；去離子水。

1.2 儀器與設備

HH-1數顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍儀器制造有限公司）；GL10M大型離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）；CT15RT臺式高速冷凍離心機（上海天美科學儀器有限公司）；VFD-6000真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；MS300加熱式恒溫電動磁力攪拌器（上海般特）；UV759S紫外-可見光分光光度計（上海精科）。

1.3 試驗方法

1.3.1 漢麻分離蛋白的制備工藝（單因素試驗）

1.3.1.1 工藝路線

漢麻脫脂粉→石油醚再次脫脂→堿液提取→離心→上清液酸沉→離心→沉淀水洗→凍干→漢麻分離蛋白粉

1.3.1.2 操作要點

脫脂漢麻籽粕經粉碎、過篩后獲得漢麻脫脂粉，與去離子水按1∶20（g/mL）料液比進行混合，用1.0 mol/L的NaOH調節料液至所需pH，放置于磁力攪拌器上，設定提取時間，在一定溫度下進行堿提。堿提結束后，在4 000 r/min轉速下離心20 min，保留上清液。測定上清液中蛋白質質量，比較不同堿提工藝條件下的蛋白提取率。對得到的漢麻籽蛋白上清液，用1.0 mol/L的HCl調節至所需pH，在4 000 r/min轉速下離心15 min，棄去上清液（同時測定上清液存留的蛋白質濃度，以計算沉淀率），將沉淀的蛋白融入去離子水中，調節pH 6.0~7.0，得到漢麻籽蛋白凝乳，真空冷凍干燥機進行干燥。獲得漢麻籽蛋白粉。

1.3.2 制備漢麻分離蛋白的工藝優化

在前期漢麻籽蛋白堿提單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對堿提pH、提取溫度、提取時間、酸沉pH這4個影響因子進行優化，比較不同工藝條件下的蛋白提取率和沉淀率，按式（1）和（2）計算。

蛋白提取率=堿提上清液中蛋白質質量/原料中蛋白質質量×100% （1）

蛋白沉淀率=100-酸沉上清液中蛋白質質量/堿提上清液中蛋白質質量×100% （2）

表1 漢麻籽蛋白提取條件正交設計因素水平表

1.4 蛋白質濃度測定方法

采用Bradford法。

1.5 蛋白質粉含量測定方法

采用凱氏定氮法。

2 結果與分析

2.1 漢麻分離蛋白提取單因素試驗

2.1.1 堿提pH對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響溶液pH改變會直接影響兩性分子蛋白質的表面帶點情況，從而影響蛋白質-蛋白質、蛋白質-溶劑間的相互作用，而使蛋白質的溶解性發生改變。

圖1 顯示，隨著pH升高，漢麻分離蛋白的提取率逐漸升高，但pH＞10.5時升高的速率減慢，變化不明顯，趨于平緩。強堿條件不僅會增加堿液用量，還可能會導致蛋白質中賴氨酸與丙氨酸或胱氨酸發生縮合反應，影響蛋白品質。結合隨著提取pH升高，蛋白沉淀率在酸性體系中略有下降，因此堿提pH選取10.5左右。

圖1 不同堿提pH下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.1.2 酸沉pH對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響

酸沉即向浸提液中加入稀鹽酸，將其pH達蛋白質的等電點附近，使浸提液中的蛋白質沉淀析出，與糖類、酚類等可溶性成分分離。漢麻蛋白在不同pH下的沉淀率和提取率見圖2。

由圖2可見，在酸沉pH 3.5~5范圍內，蛋白沉淀率和提取率變化非常接近，這是由于堿液提取導致多種蛋白質組分同時溶出，而不同蛋白質有不同的等電點所致。考慮到過酸不但增加成本，還可能會導致蛋白質變性，所以選取較溫和的pH 5.0為酸沉pH。

圖2 不同酸沉pH下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.1.3 提取時間對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響

由圖3可知，提取時間對漢麻分離蛋白的沉淀率和提取率影響甚小，在50~90 min沉淀率和提取率均只相應變化約8%。這主要是緣于漢麻蛋白質的組成特點，清球蛋白溶解性較好。綜合考慮生產成本和工藝周期，選定提取率最高的70 min作為最適提取時間。

圖3 不同提取時間下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.1.4 提取溫度對漢麻分離蛋白沉淀率及提取率的影響

蛋白質在不同溫度下有不同的溶解度，為提高蛋白質提取率，有必要測定溫度對提取率的影響。由圖4可知，隨著溫度提高，提取率逐漸上升，沉淀率變化不大。但過高的溫度會導致漢麻蛋白的變性。因此，選擇60 ℃作為最佳提取溫度。

圖4 不同提取溫度下漢麻分離蛋白沉淀率與提取率的變化

2.2 正交試驗優化漢麻分離蛋白的最佳提取工藝

料液比1∶20（g/mL），不同堿提pH、提取溫度、提取時間條件下按4 000 r/min離心20 min，測定上清液中蛋白質濃度，不同pH條件下酸沉，測定上清液中蛋白質濃度。

從表2的正交試驗結果可以看出沉淀率和提取率的提取條件影響大小都是A＞C＞B＞D，即堿提pH＞提取溫度＞酸沉pH＞提取時間，為提高漢麻蛋白沉淀率，可選取的最佳提取工藝為堿提pH 10，酸沉pH 5，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。漢麻分離蛋白提取率的最佳工藝條件為pH 10.5，酸沉pH 4.5，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。沉淀率達到64.29%，提取率為63.54%。

表2 漢麻分離蛋白提取條件正交設計試驗結果

2.3 提取工藝優化過程中漢麻分離蛋白含量監測

通過采用優化的提取工藝制備漢麻分離蛋白，課題組使用凱氏定氮法分別測定脫脂漢麻籽粕、堿提凍干后提取的蛋白粉、酸沉凍干后提取的蛋白粉及沉渣凍干后蛋白粉的蛋白質含量，結果見表3。

由表3可知，堿提酸沉法可以提取出多數漢麻分離蛋白，但仍有很多蛋白存留于殘渣中。同時有非蛋白物質溶解于堿提溶液中，并僅有部分在酸沉時與漢麻蛋白同時沉淀下來。

表3 漢麻分離蛋白含量過程監測數據

3 結論與討論

影響堿提酸沉沉淀率和提取率的條件中，堿提pH＞提取溫度＞酸沉pH＞提取時間，漢麻分離蛋白提取率的最佳工藝條件為pH 10.5，酸沉pH 4.5，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。沉淀率達到64.29%，提取率為63.54%。堿提酸沉可以獲得純度90%以上的蛋白質粉，雖然仍有部分蛋白損失的現象，但已是工業化提純蛋白質的最佳方式，試驗為探索更好的漢麻蛋白質批量提純方法提供數據支撐。