天麻總酚閃式提取工藝研究及含量測定

楊云，蔡朝霞*

華中農業大學食品科技學院（武漢 430070）

天麻（Gastrodia elata）是蘭科天麻屬多年生草本寄生植物，主產于我國云南、貴州、四川等地，其中云南昭通和貴州畢節的天麻堪稱為道地藥材。天麻塊莖在我國已經有2 000多年的藥用歷史，是重要的藥食兩用材料，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效，可用于治療小兒驚風、癲癇抽搐、頭痛眩暈、肢體麻木等病癥[1]。天麻具有豐富的酚性成分，除天麻素（4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）是天麻的主要有效成分之外，還包括對羥基芐醇、對羥基苯甲醛、4-羥基苯甲醇、香草醛、香蘭素等酚類化合物[2-7]。天麻素和對羥基苯甲醇含量是《中國藥典》2015年版中天麻質量標準制定的重要的參考指標。文獻報道，抗氧化、抑制早期炎癥反應、減輕腦缺血損傷、保護神經細胞的活性作用是天麻酚性成分共同作用的結果，因此使用天麻總酚含量作為評價天麻質量的指標或更為全面。

天麻酚類成分的傳統提取方法以水煎煮為主，其他提取方法有酶法、超聲法、超高壓等[8]。孫海燕[3]采用超聲法提取天麻總酚的含量，得到的總酚含量為5.62 mg/g；朱素英[9]采用57%的乙醇水浴提取天麻總酚，得到的總酚含量達44.96 mg GAE/g；田孟華等[2]采用40%乙醇超聲提取得到天麻總酚含量為4.47 mg/g。丁慧等[10]采用82%的乙醇，使用超高壓技術提取天麻中天麻素和對羥基苯甲醇的含量為718.69 μg/g。但是上述提取方法多存在提取時間長、有機溶劑使用多、對設備要求高等缺陷。閃式提取器[11]是根據組織破碎原理而設計的一種新型提取器，它將高速組織粉碎機和勻漿機等機械設備優勢很好地結合在一起，被廣泛應用于中草藥及其他植物成分的提取。利用高速液體破碎、高速研磨、高速攪拌和超分子滲濾技術，在常溫液體狀態下數秒至幾分鐘內把植物組織破碎、研磨至細微顆粒狀，通過細胞組織的破裂和組織外圍溶劑的快速滲透與包容，使組織內有效成分分子迅速解離并進入到溶劑體系中，并迅速實現藥材組織內外有效成分分子濃度的平衡，達到快速提取的效果。此次試驗以天麻粗粉為原料，使用中草藥組織破碎提取機器，研究天麻總酚的閃式提取工藝，并與煎煮法、超聲乙醇提取法和水浴提取法得到總酚的含量進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗器材

中草藥組織破碎提取器（ATS-150012A，北京金鼐科技發展有限公司）；高速萬能粉碎機（FW100，天津市泰斯特儀）；電子分析天平（BSA124S，賽多利斯茵泰科公司）；紫外分光光度計：Nanodrop 2000C，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；臺式高速冷凍離心機（SIGMA 3-30K，德國西格瑪離心機公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州國華電器有限公司）；超聲波內頻清洗機（SD-500DTY，寧波新芝生物科技有限公司）。

1.1.2 材料

天麻飲片由武漢健民有限公司提供，產地是云南昭通。

1.1.3 試劑

無水乙醇（AR）；Folin-酚試劑（AR），廣州飛揚生物工程有限公司；無水碳酸鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸標準品（純度＞99%），上海源葉生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總酚測定方法

采用Folin-酚比色法，參考文獻[3]的方法并略做修改。精密稱取0.500 0 g沒食子酸標準品于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；準確吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.5和1.0 mL上述溶液并分別定容至10 mL，另取6支試管，分別吸取0.1 mL上述溶液，各加5 mL水，混合，加入0.5 mL Folin-酚試劑，振蕩混勻后；反應6 min后，加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，混合均勻后加入水定容至10 mL，在37 ℃水浴中避光靜置30 min，在765 nm波長下測定其吸光度，以沒食子酸質量濃度x為橫坐標，吸光度y為縱坐標，制作標準曲線，得回歸方程y=0.678 9x+0.055 1（R2=0.999），在0.00~0.50 mg/mL范圍內，吸光度與質量濃度線性關系良好。根據吸光度和標準曲線方程計算樣品中總酚含量。天麻總酚含量（Y，mg GAE/g）按式（1）計算。

式中：C為天麻總酚質量濃度，mg/mL；v為提取液定容后的體積，mL；m為天麻樣品的質量，g。

1.2.2 單因素試驗

以不同體積分數的乙醇作為提取溶劑，準確稱取過20目篩（850 μm）的天麻樣品粉，參考文獻[12-15]和已有試驗工作基礎上，以提取時間、料液比和乙醇體積分數3個因素的水平值為研究對象。在提取時間4 min、乙醇體積分數0的條件下進行閃式提取，提取料液比分別為1∶40，1∶45，1∶50，1∶55和1∶60（g/mL），考察提取料液比對天麻中總酚得率的影響；在提取料液比1∶45（g/mL）、提取時間4 min的條件下進行閃式提取，乙醇體積分數設定為0，20%，40%，60%和80%，考察乙醇體積分數對天麻總酚得率的影響；在提取料液比1∶45（g/mL）、乙醇體積分數0的條件下進行閃式提取，提取時間分別為1，2，3，4和5 min，考察提取時間對天麻總酚得率的影響。提取液均經8 000 r/min離心15 min，吸取0.2 mL上清液，按1.2.1小節方法進行檢測。

1.2.3 正交試驗設計

在單因素的基礎上，應用SPSS 21.0軟件，設計三因素三水平的正交優化試驗，以天麻提取液中總酚得率為評價指標，確定閃式提取天麻總酚的最佳提取條件。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 天麻總酚閃式提取工藝正交試驗因素水平

1.2.4 天麻總酚提取方法的比較研究

取3份經粉碎過20目篩（850 μm）的天麻樣品粉，分別4種提取方法提取天麻總酚。其中，60 ℃水浴提取條件為料液比1∶30（g/mL）、提取時間2 h；閃式提取條件為提取時間2 min、料液比1∶40（g/mL），純水提取；超聲提取條件為料液比1∶10（g/mL）、提取時間2 h、70%乙醇的提取溶劑；煎煮法條件為8倍水提取、提取時間2 h。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間的影響

由圖1可知，在1~5 min，天麻提取液中總酚得率隨著提取時間的延長而增加。提取時間大于3 min之后，提取液中總酚得率下降，推測可能是由于提取時間延長導致天麻細胞破壁，淀粉等成分溶出與水接觸，阻礙了酚類成分的溶出，或是提取液溫度的上升導致多酚類物質的氧化加快，從而導致總酚得率下降。

圖1 提取時間對天麻總酚提取的影響

2.1.2 料液比的影響

由圖2可知，料液比在1∶40~1∶55（g/mL）范圍內，天麻提取液中總酚得率之間沒有顯著性（p＞0.05）。當料液比達到1∶60（g/mL）時，天麻提取液中多酚得率有顯著降低。顆粒物料處于合適的溶液體積范圍內，提取料液比的增加對天麻總酚成分溶出沒有明顯差別，但隨著提取溶劑的體積繼續增加，總酚得率下降。

圖2 料液比對天麻總酚提取的影響

2.1.3 乙醇體積分數的影響

由圖3可知，乙醇體積分數在0~80%范圍內，天麻提取液中總酚得率隨著乙醇體積分數的升高而減少，乙醇體積分數為0和20%時，提取液中總酚得率幾乎相近，沒有顯著性（p＞0.05）。但隨著乙醇體積分數繼續增加（20%~80%），天麻總酚含量開始下降。推測原因是天麻素等酚性成分是水溶性的，但天麻屬于根莖類藥材，含有淀粉和多糖類成分，水提液雜質較多，對后續提純處理帶來很大困難，所以選擇乙醇作為提取溶劑，但是高體積分數的乙醇會導致一些醇溶性雜質或者是脂溶性強的成分溶出增加，這些物質的溶出導致酚類成分從顆粒物料中的溶出減少，所以采用低體積分數乙醇作為天麻中天麻素等酚類成分的提取溶劑較為合適。

圖3 乙醇體積分數對天麻總酚提取的影響

2.2 正交試驗

由表2中R值可知，因素A（提取時間）對閃式提取影響最大，各因素對總酚提取的影響順序為A＞C＞B。但方差分析顯示三因素對閃式提取的影響均不顯著，再考慮到天麻水提液雜質較多，故采用乙醇作為提取溶劑，且采用低體積分數乙醇作為天麻中天麻素等酚類成分的提取溶劑較為合適。因此，最佳提取因素的組合為A1B1C2，即提取時間2 min，料液比1∶40 g/mL，乙醇體積分數20%。

表2 天麻總酚閃式提取正交試驗表及結果分析

準確稱取3份粉碎過20目篩（850 μm）的天麻樣品粉，按照最佳提取組合條件進行驗證性試驗，結果顯示提取液總酚的平均含量為35.25 mg GAE/g，與優化試驗中含量最高提取條件組的很接近，說明優化后的最佳提取條件穩定性很高。

表3 天麻總酚閃式提取方差分析表

2.3 天麻總酚提取方法的比較

將閃式提取方法與文獻報道的3種天麻總酚提取方法進行比較研究，提取結束后分別測定提取液的天麻總酚得率，結果如圖4所示。由圖4可知，4種方法提取天麻總酚的效率不同，差異較大，以閃式提取法的提取率最高，煎煮法的最低。閃式提取法的提取率較煎煮法的提高了129.40%，較60 ℃水浴提取、超聲提取分別提高了82.26%和31.20%。對于天麻總酚提取而言，煎煮法和水浴提取時間長，超聲提取消耗乙醇等有機溶劑；而閃式提取法提取時間短，而且能夠最大限度地保護提取總酚的活性，提取效率高，密閉環境操作，安全系數高。

圖4 4種提取方法提取天麻總酚得率的比較

3 結論

閃式提取器具有高速攪拌、高速破碎、高速研磨、高速勻漿的優點，在中藥材等植物提取物領域適用性強，適合植物根、莖、葉、花等軟硬材料的快速提取。此次試驗運用閃式提取法提取天麻總酚，其最佳提取工藝條件為提取時間2 min、料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分數20%，在此條件下天麻提取液中總酚得率達到35.25 mg GAE/g。與傳統煎煮法相比較，該方法提取時間大大縮短，耗費機械功率減低，是一種節能高效的提取天麻總酚成分的方法。