白背毛木耳多糖APP3a磷酸化修飾工藝及其抗氧化活性

張澤，吳欣怡，丁霄，張偉志，何京隆，陳義勇*

常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（常熟 215500）

白背毛木耳（Auricularia polytricha）屬于真菌門擔(dān)子菌綱[1]，多糖是白背毛木耳主要成分之一，研究表明白背毛木耳多糖（polysaccharides fromAuricularia polytricha，APP）具有抗腫瘤[2]、抗血栓、抗凝血、降血脂[3]等作用。用適當?shù)氖侄螌Χ嗵沁M行結(jié)構(gòu)上的化學(xué)修飾，對其生物活性有較大的影響[4-5]。對白背毛木耳多糖的研究主要集中在提取與純化[6-8]、流變特性[9]、羧甲基化修飾[4]等方面，而對白背毛木耳多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)磷酸化修飾的研究還未見報道。

前期以白背毛木耳為原料，采用熱水浸提法提取白背毛木耳多糖APP，通過離子交換柱層析和凝膠柱層析對APP進行純化，得到1個白背毛木耳多糖單一組分APP3a[4]，因此以APP3a為對象，對APP3a磷酸化修飾工藝進行探討，并利用響應(yīng)面法對APP3a磷酸化修飾工藝條件進行優(yōu)化，同時探討磷酸化APP3a（phosphorylated APP3a，P-APP3a）的抗氧化活性，旨在為磷酸化白背毛木耳多糖的工業(yè)化制備奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

白背毛木耳毛多糖APP3a（實驗室經(jīng)過DEAEcellulose離子交換柱、葡聚糖G-200 凝膠柱分離純化得到）；正丁醇、三氯甲烷、無水乙醇、三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉、濃硫酸、濃硝酸、鹽酸、過氧化氫等（均為分析純）；透析袋（截留分子量8 000~14 000，北京索萊寶科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦苯肼/DPPH（上海楷洋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器和設(shè)備

HH-W4外循環(huán)四孔水浴鍋（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；立式循環(huán)水多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；ZNCL-BS智能數(shù)顯磁力攪拌器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；1700PC紫外可見分光光度計（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；NicoletIS10傅里葉紅外光譜儀（美國Thermo Electron公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）；Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機（德國CHRIST公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 P-APP3a的制備[10]

準確稱取6 g多聚磷酸鈉和1 g三偏磷酸鈉，溶于100 mL蒸餾水中并攪拌均勻，與10 mg/mL的APP3a溶液混合，設(shè)定一定的pH、溫度和時間進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液透析48 h，透析完成后，向透析液中加入4倍無水乙醇醇沉48 h，離心棄去上清液，將沉淀冷凍干燥，得到P-APP3a備用。

1.3.2 磷酸根含量測定

采用鉬藍比色法[11]

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 磷酸化試劑比例對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

取100 mg APP3a，設(shè)定磷酸化試劑比例（三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉質(zhì)量比，g/g）1∶6，2∶5，3∶4，4∶3，5∶2和6∶1，在pH 9、反應(yīng)時間2 h、反應(yīng)溫度80 ℃條件下反應(yīng)，考察磷酸化試劑比例對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響。

1.3.3.2 反應(yīng)溫度對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

取100 mg APP3a，設(shè)定反應(yīng)溫度40，50，60，70和80 ℃，在磷酸化試劑比例6∶1、pH 9、反應(yīng)時間2 h條件下反應(yīng)，考察反應(yīng)溫度對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響。

1.3.3.3 反應(yīng)時間對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

取100 mg APP3a，設(shè)定反應(yīng)時間2，3，4，5和6 h，在磷酸化試劑比例6∶1、pH 9、反應(yīng)溫度80 ℃條件下，考察反應(yīng)時間對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響。

1.3.3.4 反應(yīng)pH對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

取100 mg APP3a，設(shè)定反應(yīng)pH 7，8，9，10和11，在磷酸化試劑比例6∶1、反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時間2 h條件下反應(yīng)，考察反應(yīng)pH對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響。

1.3.4 APP3a磷酸化反應(yīng)最佳工藝確定

基于單因素試驗結(jié)果，以磷酸化試劑比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH這4個因素為自變量，磷酸根含量為響應(yīng)值，基于中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，建立響應(yīng)值與各個因素之間的函數(shù)關(guān)系，響應(yīng)面法優(yōu)化確定APP3a磷酸化反應(yīng)最佳工藝。

1.3.5 紅外光譜分析

分別取1 mg充分干燥的APP3a和P-APP3a，與1 mg溴化鉀充分混勻并研磨后壓片，進行紅外光譜掃描（波數(shù)范圍400~4 000 cm-1）。

1.3.6 抗氧化活性的測定

1.3.6.1 羥基自由基清除能力測定[12]

分別取FeSO4（9.0 mmoL/L）和水楊酸-乙醇溶液（9.0 mmoL/L）各1.0 mL于試管中，分別加入1 mL APP3a和1 mL P-APP3a溶液（質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL），充分搖勻后加入1 mL的H2O2溶液（9 mmoL/L）啟動反應(yīng)，于37 ℃水浴反應(yīng)0.5h。將蒸餾水替代樣品溶液作為對照組，測定A510值，進行3次平行試驗，取平均值，羥基自由基的清除率按式（1）計算。

式中：A2為各濃度多糖樣品的吸光度；A1為水楊酸被蒸餾水替代測定的吸光度；A0為各濃度多糖樣品被蒸餾水替代測定的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力測定[13]

將2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mmol/L），分別加入2 mL APP3a和2 mL P-APP3a溶液（質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL），充分搖勻后避光室溫下反應(yīng)30 min，用蒸餾水替代多糖溶液，作對照組，測定A517值，進行3次平行試驗，取平均值，DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：A2為各濃度多糖樣品的吸光度；A1為DPPH被蒸餾水替代測定的吸光度；A0為多糖溶液被蒸餾水替代測定的吸光度。

1.3.6.3 超氧陰離子清除能力測定[14]

將4.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2）分別和1 mL APP3a、1 mL P-APP3a溶液（質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）置于試管內(nèi)，分別加入3.2 mL蒸餾水后混勻，于25 ℃水浴20 min，加入0.3 mL的鄰苯三酚溶液（7 mmol/L），充分搖勻后放置于25 ℃水浴鍋中反應(yīng)3 min，即刻加1滴HCl溶液（10 mol/L）終止反應(yīng)，測定A325值，進行3次平行試驗，取平均值。超氧陰離子自由基清除率按式（3）計算。

式中：A為各濃度多糖溶液的吸光度；A0為以蒸餾水替代多糖樣品測定的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 磷酸化試劑比例對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

磷酸化試劑比例對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響見圖1。磷酸化試劑比例對磷酸根含量的影響較為明顯，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉比例3∶4時，磷酸根含量達到最大值8.2%，因此適宜的磷酸化試劑比例確定為3∶4。

圖1 磷酸化試劑比例對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響見圖2。溫度達到50 ℃時，磷酸根含量達到最大值4.655%。溫度繼續(xù)升高，磷酸根含量呈下降趨勢，可能是由于溫度過高導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞降解[10]，因此確定50 ℃作為適宜的反應(yīng)溫度。

圖2 反應(yīng)溫度對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

2.1.3 反應(yīng)時間對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時間對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響如圖3所示。隨著時間延長，磷酸根含量逐步增加，反應(yīng)時間5 h時，磷酸根含量達到最大值4.94%。反應(yīng)時間進一步增加，磷酸根含量則減少，可能是多糖長時間高溫下反應(yīng)，會造成多糖降解導(dǎo)致磷酸根含量降低[10]，因此確定5 h作為適宜的反應(yīng)時間。

圖3 反應(yīng)時間對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

2.1.4 反應(yīng)pH對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

反應(yīng)pH對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響見圖4。隨著反應(yīng)pH增加，磷酸根含量呈現(xiàn)先升高再下降趨勢，反應(yīng)pH達到9時，磷酸根含量達到最大值4.78%。反應(yīng)pH大于9，磷酸根含量則開始降低，這可能是由于磷酸化試劑在較低反應(yīng)pH條件下會發(fā)生分解，而反應(yīng)pH過高會導(dǎo)致磷酸化試劑與多糖發(fā)生反應(yīng)，從而影響磷酸化效果[15]。因此適宜的反應(yīng)pH確定為9。

圖4 反應(yīng)pH對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

2.2 APP3a磷酸化工藝條件優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析

基于單因素試驗結(jié)果，以磷酸根含量為響應(yīng)值，以反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH和磷酸化試劑比例為主要要素，設(shè)計四因素三水平的組合試驗，將因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系通過回歸方程擬合，響應(yīng)面分析試驗因素與水平見表1，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2，通過Design-Expert 8.05系統(tǒng)對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

表1 響應(yīng)面分析試驗因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

通過Design-Expert軟件響應(yīng)面試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行擬合，得到響應(yīng)值磷酸根含量（R）與自變量磷酸化試劑比例（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時間（C）、反應(yīng)pH（D）之間的二次多項回歸方程的模型：R=7.34+0.42A-0.63B+0.19C-0.028D-0.41AB-0.034AC-0.073AD+0.043BC-0.15BD-0.12CD-0.48A2-2.12B2-0.80C2-1.44D2。

從表3回歸模型方差分析可以看出，該模型的F值為9.31，p＜0.000 1，表明擬合得到的模型極顯著。因素磷酸化試劑比例（A）和反應(yīng)溫度（B）均具有顯著水平（p＜0.05），其中反應(yīng)溫度對響應(yīng)值的影響最大，因素影響程度大小順序為反應(yīng)溫度（B）＞磷酸化試劑比例（A）＞反應(yīng)時間（C）＞反應(yīng)pH（D）。

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析

兩因素的交互作用對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響結(jié)果見圖5。溫度對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線最陡，磷酸化試劑比例的影響次之，反應(yīng)pH曲線最平滑，影響最不顯著。反應(yīng)溫度和磷酸化試劑比例之間的交互作用對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響最明顯，其次是磷酸化試劑比例（A）和反應(yīng)pH（D）的交互作用。磷酸化試劑比例（A）和反應(yīng)pH（D）間的交互作用及反應(yīng)溫度（B）和反應(yīng)時間（C）間的交互作用對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響不明顯。

圖5 兩因素的交互作用對APP3a磷酸化反應(yīng)的影響

2.2.3 模型的優(yōu)化和驗證

采用Design-Expert 8.05軟件分析響應(yīng)面數(shù)據(jù)，可以預(yù)測得到APP3a磷酸化反應(yīng)最佳工藝條件：磷酸化試劑比例3.49∶3.51、反應(yīng)溫度50.32 ℃、反應(yīng)時間5.07 h、反應(yīng)pH 9.13。在此條件下，磷酸根含量為7.47%。為實際操作的方便性，調(diào)整APP3a磷酸化反應(yīng)條件為磷酸化試劑比例3∶4、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間5 h、反應(yīng)pH 9.0。通過3次平行驗證試驗，得到的磷酸根含量平均值為7.41%，實際值和預(yù)測值相近，表明該模型能夠充分預(yù)測APP3a磷酸化反應(yīng)因素與磷酸根含量間的關(guān)系，證明反應(yīng)工藝參數(shù)的可行性。

2.3 紅外光譜分析

APP3a與P-APP3a的紅外光譜圖如圖6所示。APP3a和P-APP3a均有多糖類物質(zhì)紅外特征峰，在3 413.555 cm-1波數(shù)處出現(xiàn)—OH的伸縮振動吸收峰，在1 386.636 cm-1波數(shù)處出現(xiàn)C＝O的伸縮振動峰，在1 284.422 cm-1波數(shù)處出現(xiàn)P＝O伸縮振動峰，在1 079.995 cm-1波數(shù)附近出P—O—C的伸縮振動峰，由此可知APP3a磷酸化修飾成功。

圖6 APP3a和P-APP3a的紅外光譜

2.4 APP3a和P-APP3a的抗氧化作用

2.4.1 羥基自由基的清除作用

APP3a和P-APP3a對羥基自由基的清除作用見圖7。在一定的多糖濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度提高，APP3a和P-APP3a對羥基自由基的清除作用逐步增加，與APP3a相比，在同等濃度條件下，經(jīng)過磷酸化修飾的P-APP3a對羥基自由基的清除作用明顯增強，說明對APP3a磷酸化修飾能進一步提高對羥基自由基的清除能力。

圖7 APP3a和P-APP3a對羥基自由基的清除作用

2.4.2 DPPH自由基的清除作用

APP3a和P-APP3a對DPPH自由基的清除作用見圖8。在一定的多糖濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度提高，APP3a和P-APP3a對DPPH自由基的清除作用逐步增加，與APP3a相比，在同等濃度條件下，經(jīng)過磷酸化修飾的P-APP3a對DPPH自由基的清除作用有一定程度的減弱，可能是因為磷酸化多糖構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致生物活性發(fā)生變化[16]。

圖8 APP3a和P-APP3a對DPPH自由基的清除作用

2.4.3 超氧陰離子自由基的清除作用

APP3a和P-APP3a對超氧陰離子自由基的清除作用如圖9所示。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度提高，APP3a和P-APP3a對超氧陰離子自由基的清除作用逐步增加，與APP3a相比，在同等濃度條件下，經(jīng)過磷酸化修飾的P-APP3a對超氧陰離子自由基有一定程度的增強，這可能是因為經(jīng)磷酸化的多糖水溶性提高，導(dǎo)致抗氧化性增強[16]。

圖9 APP3a和P-APP3a對超氧陰離子自由基的清除作用

3 結(jié)論

以前期分離得到的白背毛木耳多糖單一組分APP3a為對象，對APP3a磷酸化修飾工藝進行探討，利用響應(yīng)面法對APP3a磷酸化修飾工藝條件進行優(yōu)化，探討P-APP3a的抗氧化活性。確定APP3a磷酸化修飾工藝條件：磷酸化試劑比例3∶4、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間5 h、反應(yīng)pH 9.0。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著APP3a和P-APP3a濃度的提高，它們對羥基自由基、DPPH自由基及超氧陰離子自由基清除作用增強，在同等濃度條件下，與APP3a相比，P-APP3a羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著加強，而對DPPH自由基清除能力有所減弱。白背毛木耳多糖經(jīng)過磷酸化修飾后導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其抗氧化活性發(fā)生變化，但是磷酸化白背毛木耳多糖抗氧化作用機理還不清楚，還需要進一步深入研究。