螺旋藻藻藍蛋白的純化及其水飲料穩定性

王天石，吳紫涵，張少斌*，李泉智

沈陽農業大學生物科學技術學院（沈陽 110866）

螺旋藻（Spirulina）是一種絲狀微藻，是地球上最古老的原核生物之一。螺旋藻已被廣泛應用于食品、飼料、化妝品、污水治理等領域[1]。藻藍蛋白是藍藻、紅藻的主要光合作用蛋白，在螺旋藻中含量高達干重的10%~20%，含有全部8種必需氨基酸[2]。藻藍蛋白呈現靚麗的天藍色，并能發射紅紫色熒光，是一種天然蛋白質色素和熒光染料[3]。藻藍蛋白還具有多種生物學活性，如抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等[4]。

隨著我國經濟的發展和社會生活水平的不斷提高，包裝飲用水、果蔬汁飲料等逐漸流行起來[5-6]。植物蛋白飲料迎合了人們對天然和健康食品的追求，年均復合增長率超過20%，發展潛力巨大[7-9]。螺旋藻藻藍蛋白不僅具有重要的營養保健價值，而且是一種天然色素，因此研究藻藍蛋白飲料具有重要的理論與應用價值。

溫度、檸檬酸等各種物理化學因素都會影響藻藍蛋白的穩定性[10-12]。已有的研究大都以磷酸緩沖液為溶劑，與直飲飲料有較大差異，此外，多以藻藍蛋白粗提取液為試驗材料，由于部分雜蛋白容易變性沉淀，影響飲料的外觀和品質。因此，此次試驗將純化的藻藍蛋白加入到包裝飲用水中，調制成藻藍蛋白水飲料，并綜合分析溫度、光強等對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響，為藻藍蛋白水飲料的食用推廣提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻直線型突變株SP-Dz[13]（實驗室保存）；羥基磷灰石（分析純，珠海嘉億生物科技有限公司）。

1.1.2 儀器與設備

Unico2100型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；F4500熒光分光光度計（日本日立公司）；HPG-280BX型光照培養箱（上海四科儀器設備有限公司）；J-HH-6A精密數顯恒溫水浴鍋（上海勝衛電子科技有限公司）；FA1004型天子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻培養

將純化的螺旋藻藻種接種在Zarrouk氏培養液中，接種濃度A560=0.3~0.5，置于溫室內光照培養，每天攪動3次，當螺旋藻處于旺盛生長期（A560=1.5~2.0）時用濾網采收，收獲的藻泥置于-20 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2 藻藍蛋白的提取純化與鑒定

將藻泥裝入小燒杯中稱其質量，按照20 mL/g的量加入0.01 mol/L CaCl2水溶液，置于冰箱中反復凍融2~3次。經10 000g離心10 min，棄去沉淀，得到藻藍蛋白的粗提液。將藻藍蛋白粗提液進行透析、過羥基磷灰石層析柱，利用分光光度計分別測定A620，A650和A280吸光度，繪制洗脫曲線，以A620/A280計算藻藍蛋白純度，并測定藻藍蛋白吸收光譜和熒光光譜。藻藍蛋白溶液經冷凍干燥，得到藻藍蛋白干粉，低溫保存。試驗前，將適量藻藍蛋白干粉加入飲用純凈水，充分溶解后離心去沉淀，得到的藻藍蛋白溶液用于藻藍蛋白水飲料穩定性研究。

1.3 藻藍蛋白水飲料穩定性研究

1.3.1 保存時間和蛋白濃度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

將藻藍蛋白溶液與飲用純凈水按一定比例混合，分別測定A620值和A650值，根據經驗公式計算藻藍蛋白的質量濃度[15]：藻藍蛋白質量濃度=（A620-0.474×A650）/5.34，見表1。將不同濃度的藻藍蛋白水飲料分別分裝多個試管，每一處理重復三個，分別放置在室溫、暗處，每12 h測定一次A620值，共測定48 h。同時觀察水飲料是否有顏色變化和沉淀產生。用不同時間測定的A620值除以起始A620值，再乘以100%，表示藻藍蛋白水飲料在不同保存時間條件下的相對穩定性。

表1 藻藍蛋白水飲料光吸光度與蛋白質質量濃度

1.3.2 溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

取純化的藻藍蛋白與飲用純凈水按一定比例混合，調節混合溶液的A620值在0.6~0.7，混勻后測定起始A620值，分裝在若干試管中，每管3 mL，試管上端加塞密封，避光，分別置于室溫（26 ℃），水溫1，37，50和65 ℃的恒溫水浴鍋中，持續保溫180 min，每隔30 min測定1次A620值，并觀察是否有顏色變化和沉淀產生。

1.3.3 光強對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

取純化的藻藍蛋白，與飲用純凈水按一定比例混合，調節混合溶液的A620值在0.6~0.7，混勻后測定起始A620值，分裝在若干試管中，每管3 mL，試管上端加塞密封。分別置于室內暗處（光照強度小于10 Lux）、室內亮（光照強度約100 Lux）、光照培養箱（光照強度約10 000 Lux），放置180 min，每隔30 min測定1次A620值，以室內散射光樣品A620值和光照培養箱內樣品A620值分別除以室內暗處樣品的A620值，再乘100%，表示藻藍蛋白水飲料在不同光照強度條件下的相對穩定性。

1.3.4 藻藍蛋白穩定性多因素試驗

取純化的藻藍蛋白，與飲用純凈水按一定比例混合，調節混合溶液的A620值在0.6~0.7，混勻后測定起始A620值，分裝在若干試管中，每管3 mL，試管上端加塞密封。基于單因素試驗結果，以光強、溫度和時間設計三因素三水平正交試驗，因素水平見表2，試驗設計見表3。將上述試管分別置于表3中所示9個試驗條件下，試驗結束時測定A620值，根據A620值下降的程度判斷藻藍蛋白水飲料的穩定性。

表2 因素水平表

表3 藻藍蛋白水飲料多因素試驗正交設計表

2 結果與分析

2.1 螺旋藻藻藍蛋白的純化與光譜分析

新鮮的螺旋藻藻泥在氯化鈣溶液中懸浮，反復凍融3次后離心，得到藻藍蛋白粗提液，其純度為0.611，遠高于超聲波法破碎藻細胞提取藻藍蛋白的純度[14]。透析除去粗提液中的鹽離子，使用羥基磷灰石吸附層析柱進行純化，洗脫曲線如圖1所示。第一個洗脫峰A的最大光吸收波長為280 nm，為1 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫下的雜蛋白，第二個洗脫峰B的最大吸收波長為620 nm，為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫下的藻藍蛋白，第三個洗脫峰C的最大吸收波長為650 nm，為100 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫下的別藻藍蛋白。在洗脫峰B中，藻藍蛋白最高純度超過4.5，合并30~40 mL之間的洗脫液，得到的藻藍蛋白純度為4.2，約為藻藍蛋白粗提液純度的7倍，高于多數已有報道[15]，同時簡化純化過程，有利于藻藍蛋白的規模化生產與應用。

圖1 羥基磷灰石柱層析純化藻藍蛋白

光譜分析是定性定量檢測藻藍蛋白的主要手段[16]。藻藍蛋白的吸收光譜如圖2所示。最大吸收峰在618 nm，溶液為天藍色。藻藍蛋白的熒光激發光譜和熒光發射光譜如圖3所示。最大熒光激發波長為618 nm，最大熒光發射波長為639 nm，為紅紫色熒光，與已有報道相近[17]，表明純化的藻藍蛋白保持了其天然結構與光學特性。將藻藍蛋白添加到包裝飲用水中制成藻藍蛋白水飲料，不僅賦予水飲料營養和保健價值，而且使飲料呈現靚麗的天藍色，作為天然蛋白質色素，同樣具有廣泛應用價值。

圖2 藻藍蛋白的吸收光譜

圖3 藻藍蛋白的熒光光譜

2.2 保存時間和蛋白質量濃度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

不同濃度藻藍蛋白水飲料A620值隨保存時間的變化如圖4所示，相對穩定性如圖5所示。藻藍蛋白水飲料隨著保存時間延長，A620值下降，不同質量濃度藻藍蛋白水飲料A620值下降趨勢基本相同。在0~12 h之內，A620值下降迅速，降至初始值的50%以下，飲料藍色變淺，其中：0.112 mg/mL的藻藍蛋白水飲料最穩定，降至初始值的49%；0.087 mg/mL的藻藍蛋白水飲料穩定性最低，降至初始值的35%。在12~36 h，A620值下降緩慢，藻藍蛋白較為穩定，不同質量濃度藻藍蛋白水飲料穩定性差異較小，均降至初始值的30%左右。36 h之后，藻藍蛋白水飲料A620值又迅速下降；在48 h時，A620值降至初始值的20%以下，此時藻藍蛋白水飲料仍為淡藍色；60 h之后，飲料幾乎失去藍色，并有少量沉淀產生。以上結果表明，純水對藻藍蛋白穩定性影響較大，純水與藻藍蛋白提取緩沖液的pH均在7.0左右，沒有明顯差別，兩者的主要區別在于離子強度，緩沖液含有約0.9%的氯化鈉，低濃度鹽離子能提高蛋白質溶解度、促進蛋白質膠體溶液穩定[18]。純水中鹽離子濃度很低，藻藍蛋白表面失去電荷排斥作用，藻藍蛋白容易形成聚集體，溶解度下降，導致光吸光度降低。

圖4 藻藍蛋白質量濃度和保存時間對水飲料穩定性的影響

圖5 藻藍蛋白質量濃度和保存時間對水飲料相對穩定性的影響

2.3 溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響見圖6。溫度在15，26和37 ℃時，3 h內，其A620值基本無變化，表明此溫度條件下藻藍蛋白水飲料非常穩定。當溫度為50 ℃時，隨著時間延長，藻藍蛋白水飲料A620值逐漸下降，每30 min下降約4%，3 h下降約24%，溶液仍為澄清透明。當溫度達到65 ℃時，A620值迅速下降，藍色變淺，并出現渾濁現象，表明在此溫度下藻藍蛋白迅速變性并沉淀。藻藍蛋白在水中的穩定性低于其在碳酸飲料中的溫度穩定性[19]，原因可能是飲料中的各種添加劑對藻藍蛋白具有一定的保護作用。上述結果表明，藻藍蛋白水飲料的配制和保存盡可能在低溫條件下，而飲用溫度最好低于50 ℃。

圖6 溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

2.4 光照強度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響

由圖7可見，相對于暗處，光照越強，A620值下降越多，與藻藍蛋白在碳酸飲料中的穩定性相似[20]。但總體下降幅度均很小，即使在強光照（10 000 Lux）條件下，3 h時A620值下降也不到5%。以上結果表明，光照強度越低，藻藍蛋白水飲料越穩定，短時間（3 h）內光照強度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響較小。

2.5 藻藍蛋白水飲料多因素穩定性研究

多因素試驗結果見表4。根據不同處理A620下降值可以看出，處理1條件下藻藍蛋白水飲料最穩定。根據K值可以看出，溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響最大，其次是保存時間，而光照強度的影響最小，這與藻藍蛋白在碳酸飲料中的穩定性相同[19]。根據每個因素平均值x，螺旋藻最佳保存條件為A1B1C1。統計分析表明，溫度和時間對藻藍蛋白穩定性的影響差異達到極顯著水平，光照強度之間的差異為顯著水平。

表4 藻藍蛋白水飲料穩定性試驗正交設計與結果

3 結論

試驗采用凍融法獲得螺旋藻粗蛋白，進一步采用羥基磷灰石吸附層析純化獲得藻藍蛋白，其純度為4.2，最大吸收波長為618 nm，最大熒光發射波長為639 nm。將藻藍蛋白與飲用純凈水混合，制得天藍色、澄清透明的藻藍蛋白水飲料。單因素試驗表明，藻藍蛋白水飲料穩定性受到藻藍蛋白濃度和光照強度的影響很小。溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性的影響最大。37℃及其以下溫度條件下，藻藍蛋白水飲料非常穩定，3 h內A620沒有明顯變化。溫度為50 ℃時，藻藍蛋白水飲料3 h內A620下降不到25%。溫度升高到65 ℃時，藻藍蛋白水飲料A620迅速下降，藻藍蛋白變性沉淀，溶液渾濁。在室溫、避光條件下，藻藍蛋白水飲料可以保持較長時間，在36 h保存時間內A620值仍保持在初始值的30%左右，溶液仍為澄清靚麗的天藍色。多因素試驗表明，溫度對藻藍蛋白水飲料穩定性影響最大，其次為保存時間，影響最小的為光照強度。藻藍蛋白水飲料穩定性最佳條件為室內暗、室溫26 ℃、保存時間30 min。綜合以上結果，藻藍蛋白水飲料應在低溫、弱光條件下配制和保存，飲用溫度最好在50 ℃以下。