酪蛋白酸鈉美拉德反應產物制備工藝優化

王博，于景華*

1. 甘肅工業職業技術學院（天水 741025）；2. 天津科技大學（天津 300457）

美拉德反應（Millard reaction）主要是反應體系中的羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質）之間經縮合、聚合生成類黑色素的反應，也被稱為羰氨反應[1]。美拉德反應對食品生產具有重要的意義。程傳玲等[2]利用山梨糖與脯氨酸的美拉德反應產物為卷煙增香；劉丹等[3]利用美拉德反應產生的肉類特征風味為兔肉增香。周張濤等[4]篩選出果糖是通過美拉德反應制備濃香葵花籽油的最佳還原糖單糖，并優化了濃香葵花籽油的制備工藝。美拉德反應產物中還存在一些具有多種生物學活性的低分子量化合物，國內外學者對美拉德反應產物的功能特性進行了深入的研究，包括抗氧化性、提高蛋白質的溶解性和乳化性、降低蛋白質過敏反應，抑菌、抗過敏、抗突變、保護心血管疾病和預防腸道炎癥等[5-6]。陳正軍等[7]用濕法制備的酪蛋白酸鈉與低聚異麥芽糖的美拉德反應產物抗氧化性能較強，能有效保護芯材成分，以其為壁材制備的混合油脂微膠囊具有良好的理化特性。Bi等[8]利用干法得到β-乳球蛋白與阿拉伯膠的美拉德反應產物，用其作為乳化劑制備的乳狀液在低pH和高鹽離子濃度下具有較好的穩定性。Li等[9]利用大米蛋白水解物與葡聚糖制備出的美拉德反應產物對大米蛋白的溶解性和乳化性有顯著改善。Dong等[10]發現利用干法反應72 h后得到的亞麻籽膠和乳清蛋白的美拉德反應產物在油水乳狀液中表現出良好的乳化性。

酪蛋白酸鈉是牛乳中主要蛋白質酪蛋白的鈉鹽，作為一種安全無害的乳化劑和增稠劑，被廣泛地應用于食品行業。GB/T 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[11]指出酪蛋白酸鈉可作為二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（ARA）的載體添加到嬰幼兒配方食品中；葡萄糖是生物體內新陳代謝不可缺少的營養物質，是人類生命活動所需能量的重要來源，被廣泛應用于食品、醫藥工業[12]。酪蛋白酸鈉-葡萄糖的美拉德反應產物可作為多功能添加劑應用到食品功能因子輸送體系中。但根據前人的研究成果，在實驗室小試的條件下制備美拉德反應產物所需的加熱時間較長，不利于工業化生產，此次研究利用實驗室超高溫殺菌機進行小試的放大試驗，在制備美拉德反應產物的同時還可對產品進行殺菌；超高溫殺菌機可與均質機、分離機、閃蒸機等設備相連，可實現連續化生產；在避免水浴、油浴等試驗方法弊端、提高生產效率的同時獲得了工業生產所需的實驗數據，加速和推進實驗室成果走向工業化生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白酸鈉、葡萄糖（美國Sigma公司）；Life’sTMDHA S35-O300藻油（荷蘭皇家帝斯曼集團）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T25 Digital高速剪切儀（德國IKA公司）；AH100D高壓均質機（ATS工業系統有限公司）；SPAKK酶標儀（TECAN公司）；Turbiscan AGS穩定性分析儀（法國Formulation公司）；實驗室超高溫殺菌機（北京博華精遠科技開發有限公司）。

1.3 酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德反應產物的制備

配制質量分數為5%的酪蛋白酸鈉（NaCN）溶液，充分水合后按一定質量比向其加入葡萄糖（glu），充分溶解后用0.2 mol/L NaOH調節起始pH；利用實驗室超高溫殺菌機在一定溫度下熱處理一定時間，得到酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德反應產物（NaCN-glu），于-20 ℃冷凍備用。

1.4 美拉德反應產物乳化活性的測定

NaCN-glu的乳化活性測定參照Pearce等[13]的方法，略做改動。取20 mL制備好的NaCN-glu溶液于50 mL燒杯中，加入2% DHA藻油，在中等剪切速度下剪切1 min，立即從燒杯底部吸取50 mL濁液，用0.1%SDS溶液定容至5 mL，渦旋后在500 nm處測定吸光度A，表示NaCN-glu的乳化活性，以0.1% SDS溶液為空白。

1.5 中試條件下美拉德反應產物制備工藝的單因素試驗設計

溶液起始pH：在酪蛋白酸鈉的濃度為5%（W/W）的條件下，固定蛋白質-糖質量比1∶1（W/W）、熱處理溫度130 ℃、反應時間15 s，考察溶液在不同起始pH（7.0，7.5，8.0，8.5和9.0）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

熱處理溫度：在酪蛋白酸鈉的濃度為5%（W/W）的條件下，固定溶液起始pH 8.0、酪蛋白酸鈉-葡萄糖的質量比1∶1（W/W）、反應時間15 s，考察在不同熱處理溫度（100，110，120，130和140 ℃）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

反應時間：在酪蛋白酸鈉的濃度為5%（W/W）的條件下，固定溶液起始pH 8.0、蛋白質酪蛋白酸鈉-葡萄糖的質量比1∶1（W/W）、熱處理溫度130℃，考察在不同反應時間（5，10，15，20和30 s）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

底物配比：在酪蛋白酸鈉的濃度為5%（W/W）的條件下，固定溶液起始pH 8.0、熱處理溫度130℃、反應時間15 s，考察酪蛋白酸鈉與葡萄糖在不同的質量比（2∶1，1∶1，2∶3，1∶2和1∶3）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

1.6 中試條件下美拉德反應產物制備工藝的正交試驗設計

根據單因素的試驗結果，以乳化活性為評價指標，選擇熱處理時間（A）、熱處理溫度（B）和底物配比（C）三個因素按正交表L16(43)進行試驗，正交試驗的因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.7 DHA藻油乳狀液的制備及穩定性快速評價

以上一步得到的NaCN-glu溶液作為水相，向其緩慢加入10%的DHA藻油（油相），在中等剪切速度下剪切3 min得初乳狀液，然后經高壓均質機在（35±5）MPa下均質3次得到最終的乳狀液，迅速冷卻至室溫；在相同的條件下以未經美拉德反應的酪蛋白酸鈉作為乳化劑制備DHA藻油乳狀液作為空白對照。利用Turbiscan AGS穩定性分析儀對乳狀液的穩定性進行快速分析[14]。取1.7中制備的乳狀液各20 mL于樣品瓶中，將樣品瓶放入檢測池中，溫度設定25 ℃，每1 h掃描1次，掃描24 h，記錄掃描圖譜。試驗重復測定3次。

1.8 統計分析

采用SSPS 20.0軟件對數據進行處理，結果以x±s表示。采用單因素方差分析來分析組間差異性，以p＜0.05表示差異顯著，使用軟件Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 起始pH對美拉德反應產物乳化特性的影響

美拉德反應在堿性條件下更容易發生，當反應體系的pH大于3時，反應速率隨pH升高而加快，但pH過高，反應速率則難以控制，導致蛋白質、糖或中間產物降解成小分子物質。在此次試驗中，當反應體系的起始pH大于8時，得到的NaCN-glu的乳化能力有輕微下降的趨勢。盡管酪蛋白酸鈉在等電點時的乳化力最小，在堿性條件下其乳化力顯著增大，但在嬰幼兒配方奶粉等食品的實際生產過程中，應盡量使體系的pH保持在中性范圍，否則會影響食品中其他蛋白的穩定性，所以選擇反應體系的起始pH 8.0，反應結束后溶液的pH在7.6左右，較為合理。

圖1 pH對NaCN-glu乳化活性的影響

2.2 熱處理溫度對美拉德反應產物乳化特性的影響

熱處理溫度對美拉德反應影響顯著，從而對NaCNglu的乳化活性產生影響。熱處理溫度相差10 ℃，褐變速率相差3~5倍[1]。由圖2可知隨熱處理溫度的升高，NaCN-glu的乳化活性先增大后減小，130 ℃時達到最大0.63，顯著高于其他熱處理溫度（p＜0.05）。低溫時美拉德反應速率較慢，當溫度升高到140 ℃以上時，反應速率過快，不易控制，熱處理15 s后溶液的顏色已明顯加深，可能已經進入美拉德反應后期生成類黑精物質，影響產物的乳化特性。所以選取130℃為熱處理溫度，再進行下一步篩選。

圖2 熱處理溫度對NaCN-glu乳化活性的影響

2.3 熱處理時間對美拉德反應產物乳化特性的影響

由圖3和圖4可知，隨熱處理時間的延長，NaCNglu的乳化活性先增大后減小，15 s時達到最大，當熱處理時間超過15 s時，結合在蛋白質上的糖分子數過多，NaCN-glu過度親水使其在油-水界面的吸附能力下降，同時體系內發生環化和降解等反應導致美拉德反應產物的相對分子質量差別逐漸增大，相對分子質量的兩極分化會對蛋白質的乳化能力造成不良影響，從而對產物的乳化能力造成不利的影響。所以為得到較高乳化活性的美拉德反應產物，應控制美拉德反應程度，在此次試驗條件下，選取熱處理時間15 s。

圖3 熱處理時間對NaCN-glu乳化活性的影響

2.4 底物配比對美拉德反應產物乳化特性的影響

由圖5可知，隨體系中葡萄糖濃度的增大，NaCNglu的乳化活性先增大后減小。當酪蛋白酸鈉與葡萄糖的質量比由2∶1減小到1∶1時，NaCN-glu的乳化活性增長極為顯著（p＜0.01），這是因為平均每個酪蛋白分子上有14個氨基（包括N端氨基），可與葡萄糖的還原端羰基發生反應，當反應體系內的葡萄糖濃度增加，可以提供更多的羰基時，與酪蛋白酸鈉結合的葡萄糖更多，得到的羰氨產物使體系的乳化活性升高。但若體系內的葡萄糖過多，隨熱處理時間的延長，酪蛋白酸鈉分子部分伸展使內部的ε-氨基逐漸暴露在分子表面，羰基與氨基進一步縮合使結合在蛋白質上的親水基過多，不能平衡油水界面的張力，導致乳化活性有明顯的下降。綜上所述，選擇底物配比1∶1較為合適，從生產成本角度考慮也更為經濟合理。

圖5 底物配比對NaCN-glu乳化活性的影響

2.5 正交試驗結果分析

通過單因素試驗確定了對NaCN-glu乳化活性影響較大的三個因素及其范圍，即熱處理時間（A）、熱處理溫度（B）和底物配比（C）。在酪蛋白酸鈉濃度5%（W/W）、起始pH 8.0的條件下，以乳化活性（EA）為評價指標，按正交表L16(43)設計正交試驗，考察三個因素對NaCN-glu乳化活性的綜合影響，確定酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德反應的最佳制備工藝，正交試驗結果和方差分析見表2和表3。

表2 正交試驗設計與結果

根據極差R的大小可知各因素對NaCN-glu的乳化活性影響的順序為C＞B＞A，即底物配比＞熱處理溫度＞熱處理時間。由表3方差分析的結果可以看出，底物配比對NaCN-glu的乳化活性影響極顯著，熱處理溫度影響顯著，熱處理時間影響不顯著。綜合直觀分析與方差分析的結果，確定了制備高乳化活性的NaCN-glu的最優組合A3B4C2，即熱處理時間15 s，熱處理溫度130 ℃，酪蛋白酸鈉與葡萄糖的底物配比1∶1（W/W）。

表3 正交試驗結果方差分析

2.6 驗證試驗

根據正交試驗得到的最佳的酪蛋白酸鈉美拉德反應產物制備工藝，即在酪蛋白酸鈉的濃度5%（W/W）、起始pH 8.0的條件下，酪蛋白酸鈉與葡萄糖的質量比為1∶1（W/W），130 ℃熱處理15 s制備的酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德反應產物的乳化活性為0.64，優于正交試驗結果，說明優化工藝可靠。

2.7 DHA藻油乳狀液的穩定性

Turbiscan AGS穩定性分析儀采用近紅外作為光源，與透射光檢測器和背散射光檢測檢測器組成測量探頭，對樣品池從底部到頂部每40 μm掃描1次，在一定時間內連續掃描，獲得透射光與背散射光信號對樣品高度的函數曲線圖，即可反映出樣品中顆粒的運動趨勢，進而預測出乳狀液的穩定性。

此次試驗所制備的DHA藻油乳狀液總固形物含量較高，幾乎沒有透射光，所以選擇背散射光對樣品進行分析。圖6（a）和（b）分別為試驗組NaCN-glu和對照組NaCN的背散射光光強隨時間變化的掃描圖譜，圖中橫坐標從左到右代表樣品瓶底部、中部和頂部，縱坐標為背散射光光強的變化情況（以第一次掃描結果為參比）。由圖6可知，兩樣品均呈現底部的背散射光逐漸減小，頂部的背散射光先增加后減小的趨勢，根據背散射光光強隨體系濃度的減小而減小，增大而增大的理論[15]，試驗組和對照組樣品均在底部出現澄清層，頂部出現脂肪上浮層，并且頂部脂肪上浮后顆粒之間發生了絮凝，使背散射光光強減小；圖中的峰寬代表澄清層和脂肪上浮層的厚度[16]，可以看出在相同的條件下，試驗組NaCN-glu的澄清層和脂肪上浮層厚度均小于對應的對照組NaCN樣品；樣品瓶中部的光強不重合，說明顆粒粒徑變化明顯，圖6（b）的光強波動幅度更大，即粒徑變化更大，乳狀液更不穩定。由此可以證明酪蛋白酸鈉經美拉德反應改性后的乳化性有明顯的提高。

圖6 不同DHA藻油乳狀液Turbiscan掃描圖譜

3 結論與討論

美拉德反應可以改善蛋白質的功能特性。葡萄糖可以作為一種優良的糖基配體通過美拉德反應顯著改善酪蛋白酸鈉的乳化性。當酪蛋白酸鈉的濃度為5%（W/W），酪蛋白酸鈉與葡萄糖的質量比為1∶1（W/W），溶液起始反應pH為8.0時，酪蛋白酸鈉-葡萄糖混合液經130 ℃熱處理15 s得到的美拉德反應產物的乳化性能較好，與水浴90 ℃熱處理90 min相當，是同等條件下酪蛋白酸鈉的2倍，可作為新型乳化劑應用于DHA等功能因子輸送體系的制備。此方法可實現連續化、高效率制備高乳化活性酪蛋白酸鈉-葡萄糖美拉德反應產物，極大地縮短了熱處理時間，對工業化生產具有指導意義。