DSPE-LC-MS/MS法測定泥鰍中16種喹諾酮類藥物殘留

唐秀 ，范廣宇*，宋蘇，梁夏夏，王文彬*，姚燕林

1. 江蘇海洋大學（連云港 222005）；2. 連云港海關（連云港 222042）

泥鰍在我國分布廣泛，其肉味道鮮美且富含優質蛋白質、脂肪酸、多種礦物元素及B族維生素，素有“水中人參”之美譽，具有較高的營養價值[1-2]，深受國內外消費者喜愛。江蘇省連云港市作為全國泥鰍養殖和出口的重要地區，出口活泥鰍已有近20年的歷史[3]，一直占據著韓國絕大部分市場份額。喹諾酮類（quinolones，QNs）藥物具有抗菌譜廣、抗菌力強、安全性高、價格低廉、毒副作用低等特性，被長期廣泛應用于泥鰍養殖中，但使用不當會造成喹諾酮類藥物在泥鰍體內殘留，對人體構成潛在威脅。近年來韓國等主要進口國對泥鰍的藥物殘留要求越來越高，輸往韓國的養殖水產品中諾氟沙星、培氟沙星和氧氟沙星的限量要求不得檢出，據中國技術性貿易措施網數據，2017年以來韓國因喹諾酮類超標扣留我國出口泥鰍8批次。

目前，喹諾酮類藥物檢測常用的方法有免疫分析法[4-5]、毛細管電泳法[6]、液相色譜法[7-10]、液相色譜-串聯質譜法[11-16]、液相色譜-高分辨質譜法[17]等。液相色譜-串聯質譜法的分析時間短，檢出限低，準確性和靈敏度高，在喹諾酮類藥物殘留檢測中應用較廣。泥鰍基質復雜，含有大量的脂肪、蛋白質、碳水化合物以及色素等雜質，儀器檢測之前需要去除，處理不當將影響藥物殘留的檢測，造成結果不準確、儀器污染等，因此樣品的前處理尤為重要[18]。水產品中喹諾酮類藥物殘留檢測廣泛采用的前處理方法主要有固相萃取法[7,15,19,22]、液液萃取法[20]、分子印跡法[21]、加速溶劑萃取法[6,22]、分散固相萃取法[8,23-24]等。分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）法是直接在提取液中加入固相吸附劑凈化然后測定，具有快速、簡單、靈活等特點，可用于不同性質藥物的快速篩查。分散固相萃取法用于泥鰍中喹諾酮類藥物檢測的研究較少，此次試驗基于分散固相萃取和高效液相色譜-串聯質譜，建立一種同時檢測泥鰍中16種喹諾酮類藥物殘留的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500液相色譜-串聯質譜儀，美國AB SCIEX公司；Analyst工作站；XS 204分析天平，瑞士Mettler公司；KH-800KDB型高功率數控超聲波，昆山禾創超聲儀器有限公司；A10 Milli-Q超純水機，美國Millipore公司；TDL-40B型離心機，上海安亭科學儀器廠；N-EVAP 112氮吹儀，美國Organomation公司；XW-80A型漩渦混合器，上海青浦滬西儀器廠。

恩諾沙星（enrofloxacin）、麻保沙星（marbofloxacin）、奧比沙星（orbifloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、氟羅沙星（fleroxacin）、培氟沙星（pefloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、司帕沙星（sparfloxacin）、丹諾沙星（danofloxacin）、依諾沙星（enoxacin）、萘啶酸（nalidixic acid）、氟甲喹（flumequine）、雙氟沙星（difloxacin）、沙拉沙星（sarafloxacin）、環丙沙星（ciprofloxacin）、洛美沙星（lomefloxacin），德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度＞92%；環丙沙星-D8（ciprofloxacin-D8）、恩諾沙星-D5（enrofloxacin-D5）、諾氟沙星-D5（norfloxacin-D5）、培氟沙星-D5（pefloxacin-D5）、氧氟沙星-D3（ofloxacin-D3），德國Witega公司，純度＞99%；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18），美國Agilent公司；中性氧化鋁吸附劑（Alumina-N），上海安譜實驗科技股份有限公司；硅鎂型吸附劑（Florisil），上海潤捷化學試劑有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，德國Merck公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、甲酸、乙酸，均為優級純，中國國藥試劑公司。試驗用水為超純水。樣品購自本地市場。

1.2 標準溶液的配制

儲備液：準確稱取適量上述標準品，用甲醇溶解定容配制成100 mg/L的標準儲備液。

混合標準溶液：分別取一定量的單標儲備液，用初始流動相稀釋成1 mg/L的16種喹諾酮類混合標準溶液和1 mg/L的5種氘代內標混合標準溶液，使用之前再稀釋至所需濃度。

1.3 樣品處理方法

準確稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，從1 mg/L的內標混合標準溶液中取25 μL加入樣品中，加入10 mL含2%（V/V）乙酸的乙腈旋渦混勻，然后超聲提取10 min，加入5 g無水Na2SO4旋渦混勻2 min，以3 500 r/min離心后取5 mL上清液氮吹至干，用1 mL甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液溶解定容，加入60 mg PSA漩渦混勻1 min，以3 500 r/min離心后取上清液過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.4 液相色譜條件

ACE UltraCore 2.5 Super C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣體積5 μL；流動相，0.1%（V/V）甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序：0~3.5 min，10% B~35% B；3.5~6 min，35% B~90% B；6~7 min，90% B；7~7.1 min，90% B~10% B；7.1~10 min，10% B。

1.5 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描、多反應監測（MRM）模式；去溶劑溫度（TEM）為500 ℃；電噴霧電壓（IS）為5.5 kV；入口電壓（EP）和碰撞室出口電壓（CXP）分別為10和6 V；所用氣體均為高純氮氣；碰撞氣（CAD）、氣簾氣（CUR）、霧化氣（GS1）、輔助氣（GS2）的壓力分別為41.4，207，345和345 kPa。16種喹諾酮類藥物和5種氘代內標物的質譜參數見表1。

表1 16種喹諾酮類藥物及5種內標物的保留時間、監測離子對、碰撞電壓和去簇電壓

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

考察了甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液和乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相時目標化合物的響應值、分離效果和色譜峰形。結果表明，相比前者，后者色譜峰分離度和峰型不好，故選擇甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相進行分離。在優化條件下，16種喹諾酮類藥物的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 16種喹諾酮類藥物的提取離子色譜圖

2.2 質譜條件優化

采用直接進樣方式注入0.1 mg/L的16種喹諾酮類藥物的混合標準溶液和0.2 mg/L的5種氘代喹諾酮類內標混合標準溶液，ESI正離子模式下進行一級質譜分析，確定每種藥物的母離子，再對母離子進行二級質譜掃描，選取兩個相對豐度較高的碎片離子分別作為定量和定性離子，優化去簇電壓和碰撞電壓，優化后參數見表1。

2.3 提取條件的優化

乙腈有較好的去除蛋白質的作用，不僅對蛋白質具有良好的沉淀、去除效果，也對脂類、高疏水性化合物等雜質具有良好的去除效果，而泥鰍樣品中的蛋白質含量較高，因此選擇乙腈作為提取溶劑。試驗對比了純乙腈、2%乙酸-乙腈和2%甲酸-乙腈的提取效果，結果發現溶劑中加入酸后平均回收率明顯增加，有助于目標檢測物的提取。同時發現2%乙酸-乙腈和2%甲酸-乙腈的提取效果差別不大，考慮到甲酸的酸性和腐蝕性均大于乙酸，所以選取2%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

試驗還對比了超聲0，5，10，15和20 min的提取效果，結果發現超聲10 min即可得到最佳的回收率。

2.4 凈化條件的選擇

分散固相萃取法可以避免固相萃取柱繁瑣和耗時的過程，因此選擇分散固相萃取法對樣品進行提取凈化并研究凈化條件的影響。對比了5 g無水Na2SO4、1 g NaCl+4 g無水Na2SO4、1 g NaCl+4 g無水MgSO4的影響，結果顯示使用無水MgSO4回收率明顯降低，而只加無水Na2SO4的平均回收率最好。

試驗分別對比了100 mg PSA、100 mg C18、100 mg Florisil、100 mg Alumina-N、50 mg PSA+50 mg C18和50 mg PSA的凈化效果，結果表明，單獨使用PSA時的凈化效果好于C18、Florisil和Alumina-N，PSA和C18同時使用時沒有明顯差異，因此選擇單獨使用PSA。

進一步對比了不同用量的PSA對目標化合物回收率的影響，結果見圖2。當PSA用量達到60 mg時，回收率在70%~110%之間的目標化合物最多；當用量超過60 mg后，回收率低于70%的目標化合物明顯增多，因此凈化劑選取60 mg PSA。

2.5 方法學評價

2.5.1 標準曲線、線性關系、檢出限和定量限

分別配制質量濃度為0.1，0.2，0.5，1，5，10和20 μg/L的標準溶液，內標溶液的質量濃度均為1 μg/L。以各目標物定量離子的峰面積與內標物定量離子的峰面積比為縱坐標（Y），各目標物質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，相關系數均大于0.995，線性關系良好。以S/N≥3確定檢出限（LOD），以S/N≥10確定方法的定量限（LOQ），具體數值見表2。

表2 16種喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.5.2 精密度與回收率

采用空白泥鰍樣品進行添加回收試驗，加標水平分別為1，2和10倍定量限，按照1.3小節處理，每個水平重復測定6次，16種喹諾酮類藥物的平均回收率為60.0%~112.2%，相對標準偏差為1.6%~13.3%，方法的回收率和精密度結果見表3。

表3 16種喹諾酮類藥物的回收率和精密度（n=6）

2.5.3 實際樣品測定

將該方法應用于18批泥鰍樣品的檢測，其中檢出5批次恩諾沙星、2批次環丙沙星和2批次氧氟沙星，含量范圍分別為0.5~28.5，0.7~6.3和0.2~0.6 μg/kg，說明泥鰍中喹諾酮類藥物殘留風險較大。

3 結論

利用分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法，建立同時檢測泥鰍中16種喹諾酮類藥物的分析方法。將該方法應用于泥鰍樣品檢測，其中有多批次樣品檢出喹諾酮類藥物殘留。該方法簡便、快速、靈敏度高，能夠對樣品中的目標化合物進行準確的定性和定量分析，可用于泥鰍樣品中16種喹諾酮類藥物的快速檢測，在提高泥鰍出口監管工作效率方面具有重要意義。