閥切換在線凈化技術(shù)檢測魚肉罐頭中苯并(a)芘

李亞，梁劍鋒*，梁美艷，卓梅芳，鐘水橋

1. 梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院（梧州 543002）；2. 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所（梧州 543002）

苯并芘是一種含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，按照苯環(huán)稠合位置可分為2種：苯并[a]（1, 2-苯并芘）芘和苯并[a]芘（4, 5-苯并芘）。其中，在食品中常見的苯并芘為苯并[a]芘，其可引起人體局部組織的癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA、肺細(xì)胞和肝細(xì)胞損傷，因此有強(qiáng)烈的致癌作用，被國際衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[1-3]。苯并芘容易在水體、土壤和農(nóng)作物中殘留，而水產(chǎn)品中苯并芘的來源主要包括原料污染和加工過程污染，如養(yǎng)殖水污染造成在生物體內(nèi)富集，燒烤、煙熏、烘烤時(shí)受高溫影響發(fā)生裂解與熱聚合等反應(yīng)形成[3-6]。

魚罐頭是以新鮮或冷凍的魚為原料，經(jīng)加工處理、裝罐、加入調(diào)味料、密封、殺菌等加工過程制成的即食罐頭產(chǎn)品，按照加工工藝可以分為紅燒、茄汁、煎炸、清蒸、煙熏、油浸、水浸等類別[7]。由于魚肉中含有豐富蛋白質(zhì)和在加工過程使用大量油脂，而且加工過程為達(dá)到魚肉罐頭有特殊色、香、味，往往采用煎炸、紅燒、殺菌等高溫加工工藝，容易發(fā)生裂解和聚合反應(yīng)生產(chǎn)有害物質(zhì)苯并芘。近年來隨著中國社會(huì)與經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，食品安全公共衛(wèi)生問題也隨之頻發(fā)，特別在2010年國內(nèi)出現(xiàn)茶籽油中苯并芘超標(biāo)食品安全事件后，公眾對苯并(a)芘在食品中殘留越發(fā)關(guān)注[8-11]。因此，研究魚肉罐頭中苯并(a)芘方便、快捷的檢測方法，對保障公眾食品安全具有重要意義。

苯并(a)芘常用檢測方法有熒光分光光度法、薄層色譜法、免疫學(xué)法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用法等[12-16]。這些常用的檢測方法在前處理過程中需要采用高毒害性有機(jī)試劑二氯甲烷作為溶劑萃取，同時(shí)需要成本較高的苯并(a)芘分子印跡柱凈化提取液，還需要氮吹儀濃縮等手工操作步驟[17]，整個(gè)檢驗(yàn)過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，檢驗(yàn)效率不高。近年來隨著閥切換在線凈化-超高速液相色譜儀聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展，其越來越多地被應(yīng)用在復(fù)雜的食品安全檢測領(lǐng)域，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在線凈化與檢測分析在系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成，具有前處理簡單、靈敏度及回收率高的優(yōu)點(diǎn)[18-21]。試驗(yàn)采用閥切換在線凈化系統(tǒng)應(yīng)用于魚肉罐頭中苯并(a)芘的檢測，簡化檢測過程中樣品前處理步驟，提高檢測自動(dòng)化程度，減少有害有機(jī)試劑的使用，保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉罐頭（市售）；正己烷、二氯甲烷、乙腈、異丙醇（色譜級，德國CNW公司）；SPE印跡柱（規(guī)格500 mg/6 mL，北京迪科馬科技有限公司）；苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度20 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）。

1.2 儀器與設(shè)備

1290液相色譜儀[含2個(gè)高壓泵、1個(gè)六通閥、熒光檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司]；色譜柱Kromasil反C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，瑞典阿克蘇諾貝爾公司）；色譜柱ChromSpher Pi（80 mm×3.0 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；ST 16R冷凍離心機(jī)（美國熱電公司）；MP-48正壓固相萃取（睿科集團(tuán)股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用正己烷-異丙醇（體積比1∶1）混合溶液將苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度20 μg/mL）稀釋至50 ng/mL苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液，用正己烷-異丙醇混合溶液逐級稀釋質(zhì)量濃度為1.0，2.5，5.0，7.50和10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理方法

稱取2.50 g經(jīng)粉碎混勻樣品置于15 mL離心管中，加入正己烷-異丙醇混合溶液至5.00 mL，搖勻，用渦旋器混合3.0 min，將離心管放入冷凍離心機(jī)離心4.0 min（4 ℃、4 000 r/min），取出離心管放置至室溫后吸取溶液的上清液，用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，初濾液棄去，濾液放置在液相進(jìn)樣小瓶待測。

1.3.3 系統(tǒng)分析過程

樣品提取濾液經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣后系統(tǒng)切換閥處于圖1（A）所示狀態(tài)，樣品進(jìn)入系統(tǒng)第1根色譜柱分析，通過該色譜柱可以將樣品中大部分非極性、小極性雜質(zhì)分離出來，經(jīng)閥門3直接進(jìn)入廢液池去除，同時(shí)目標(biāo)物可以富集在該色譜柱上。系統(tǒng)工作過程如圖1（A）所示。

系統(tǒng)分析一段時(shí)間樣品后，通過控制六通閥進(jìn)行系統(tǒng)中管路切換（如圖1B所示），同時(shí)將系統(tǒng)色譜的流動(dòng)相比例改變，將第1根色譜流出的富集的目標(biāo)分析物洗脫出來，目標(biāo)分析物進(jìn)入第2根色譜柱分析后進(jìn)入熒光檢測器定量分析完成檢測后系統(tǒng)中六通閥切回到圖1A所示狀態(tài)，流動(dòng)相改變回初始比例，系統(tǒng)平衡5 min后進(jìn)行下次測定。

圖1 閥切換系統(tǒng)工作示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

在實(shí)際樣品檢測過程中，通過考察不同色譜柱、流動(dòng)相條件、柱溫箱溫度進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定采用Kromasil反C18色譜柱作為樣品中雜質(zhì)去除、富集目標(biāo)分析物的色譜柱，流動(dòng)相采用乙腈-水（體積比82∶18），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量500 μL（500 μL定量環(huán)）。使用ChromSpher Pi色譜柱對洗脫出的目標(biāo)分析物進(jìn)一步分離，流動(dòng)相采用異丙醇-乙腈（體積比65∶35），流速1.2 mL/min，柱溫40 ℃，F(xiàn)LD（熒光）檢測器，發(fā)射波長406 nm，激發(fā)波長384 nm。目標(biāo)分析物苯并(a)芘色譜圖見圖2，檢測的苯并(a)芘陽性樣品色譜圖見圖3。

圖2 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖3 陽性樣品色譜圖

2.2 系統(tǒng)中六通閥切換時(shí)間考察

為確定合適系統(tǒng)六通閥切換時(shí)間，需要確定樣品、目標(biāo)分析物苯并芘在第1根色譜柱Kromasil反C18的各自的大致出峰時(shí)間（見圖4）。由圖4可知，樣品中非極性、小極性雜質(zhì)基本上在3.2 min前被洗脫出色譜柱進(jìn)入廢液池，而樣品中目標(biāo)分析物在3.5 min后被洗脫出色譜，因此將系統(tǒng)中六通閥切換時(shí)間確定在3.5 min。如果過早切換系統(tǒng)六通閥會(huì)，樣品中過多的雜質(zhì)帶入第2根色譜分離柱，增加第2根色譜柱分離難度，從而影響整個(gè)系統(tǒng)的分離效果，可能造成檢測結(jié)果偏高；在3.5 min后切換六通閥會(huì)導(dǎo)致部分目標(biāo)分析物被洗脫到廢液池，導(dǎo)致方法回收率降低、檢測結(jié)果偏低。

2.3 方法學(xué)考察

使用貯備標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為1.0，2.5，5.0，7.50和10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照色譜條件進(jìn)樣檢測，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)熒光峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)和范圍。試驗(yàn)方法的苯并(a)芘在1.0~10.0 ng/mL范圍內(nèi)樣品濃度與響應(yīng)值之間呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=0.478 8X+0.012 0，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 1，具有良好線性關(guān)系。對質(zhì)量濃度1.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣8次得到方法重現(xiàn)性及3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=8）為3.35%，檢出限為0.08 μg/kg（色譜圖見圖5）。

圖5 試驗(yàn)方法的檢出限色譜圖

2.4 樣品的測定

從市場上購買5批次魚肉罐頭（分別編號T1~T5），分別采用雙柱在線凈化檢測系統(tǒng)和GB 5009.27—2016進(jìn)行測定，每份樣品重復(fù)測定6次，兩種方法檢測結(jié)果分別見表1。

表1 實(shí)際樣品檢測結(jié)果（n=6）

試驗(yàn)考察閥切換超速液相色譜儀系統(tǒng)與G B 5009.27—2016在檢測結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等方面差異。從5份實(shí)際樣品檢測結(jié)果可知，試驗(yàn)方法在分析結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)與國標(biāo)方法相近。

2.5 方法回收率與精密度

對市場上購買的常見5批次魚肉罐頭中添加苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行1，5和10 μg/kg的3個(gè)水平添加，每個(gè)添加水平做6次測定，分別采用閥切換在線凈化系統(tǒng)與國標(biāo)方法測定法計(jì)算回收率和精密度，試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。

表2 試驗(yàn)方法的回收率、精密度測定結(jié)果（n=6）

表3 國標(biāo)方法的回收率、精密度測定結(jié)果（n=6）

從測定結(jié)果可以看出，閥切換超高速液相色譜系統(tǒng)方法回收率在81.62%~94.85%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為2.11%~4.22%，與國標(biāo)方法在加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差方面結(jié)果接近，表明該系統(tǒng)試驗(yàn)結(jié)果符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中回收率和精密度的要求，方法檢出限滿足含量在μg/kg級別的檢測要求[22]，表明試驗(yàn)方法適用于魚肉罐頭中苯并(a)芘的檢測。

3 結(jié)論

試驗(yàn)方法通過六通閥的切換，使檢測樣品只需通過簡單提取后，便可在系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)自動(dòng)在線凈化、富集、檢測等檢測過程，適用于魚肉罐頭等富含蛋白、脂肪的復(fù)雜食品中苯并芘的定量分析，該系統(tǒng)無需采用價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜的苯并芘分析專用的SPE印跡柱，從而降低檢測成本、提高檢測效率，同時(shí)整個(gè)檢測過程中無需用到二氯甲烷等劇毒有機(jī)試劑，保護(hù)試驗(yàn)檢測人員的健康及操作環(huán)境，試驗(yàn)方法在檢出限、加標(biāo)回收率、精密度方面與國標(biāo)檢測方法相一致，可應(yīng)用于高脂肪、高蛋白復(fù)雜食品基體中苯并(a)芘的快速檢測分析。