SPE/GC-MS測定3種水產品中的喹哪啶殘留

徐閃浪 ，黃和 *，高平*，陳日檬，曾丹丹，陳營壽

1. 廣東海洋大學食品科技學院（湛江 524088）；2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室（湛江 524088）；3. 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室（湛江 524088）；4. 廣東海洋大學分析測試中心（湛江 524088）；5. 湛江市食品藥品檢驗所（湛江 524022）

漁用麻醉劑是通過抑制活的水產品中樞神經系統來緩解其應激反應，降低運輸途中的傷亡率，減少經濟損失目的的藥物，在國內外被廣泛應用于水產品的捕捉、運輸、取樣、測量等漁業生產和科學研究的過程中[1-2]。喹哪啶（又稱2-甲基喹啉）是一種無色油狀的喹啉類化合物，廣泛應用于醫藥、染料制備等方面[3]。喹哪啶可用于魚類的短時間麻醉操作輔助活魚運輸。相比較于其他漁用麻醉劑，喹哪啶快速誘導、恢復迅速，且價格低廉，成為新興的漁用麻醉劑之一[4-5]。但喹哪啶具有一定毒性，對小鼠的LD50為1 230 mg/kg[6]，對人的皮膚、眼睛、黏膜、上呼吸道具有刺激性作用，此外有試驗研究表明喹哪啶對人體具有慢性致突變作用[7]。倘若其殘留在水產品中，可能對人體健康造成一定危害。對于漁用麻醉劑的管理，國內缺乏有效的使用標準[8]，為避免喹哪啶在水產品生產和流通過程中泛濫使用，對水產品中喹哪啶麻醉劑殘留進行準確高效的檢測具有重要的實際意義。

有關喹哪啶檢測方法報道相對較少，主要有紫外分光光度（UV）法、氣相色譜（GC）法[9]和液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法[10-11]。UV法靈敏度較低，定性定量不準，不適合用于痕量分析；GC法雖然操作簡單，普及性較廣，但容易受到復雜基質的干擾，從而影響目標物的準確定性與定量；LC-MS/MS法抗干擾能力強，靈敏度高，定性準確，但儀器昂貴。以南美白對蝦、石斑魚和鱖魚為試驗對象，采用氣相色譜-質譜法[12-14]結合固相萃取法[15-16]，建立水產品中喹哪啶麻醉劑殘留的檢測方法，為水產品中喹哪啶殘留的測定提供新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

喹哪啶（CAS號91-63-4，純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈、正己烷、乙酸乙酯（均為HPLC級，美國Honeywell公司）；固相萃取柱：乙二胺-N-丙基柱（PSA，500 mg，6 mL）、氨基柱（NH2，500 mg，6 mL）、弗羅里硅土柱（Florisil，1 000 mg，6 mL）、硅膠柱（Silica，1 000 mg，6 mL，艾杰爾科技有限公司）；苯基柱（Phenyl，500 mg，6 mL，美國Agilent公司）；石墨化炭黑柱（GCB，500 mg，6 mL，美國Supelco公司）；均質子（1 cm×2 cm，美國Agilent公司）

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀，配有電子轟擊離子源（EI）（日本SHIMADZU公司）；RV10旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；Centrisartg-16C高速冷凍離心機（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；Vac Elut 20固相萃取裝置（美國Agilent公司）；Milli-Q IQ7000超純水機（德國Merck公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取適量喹哪啶標準品（精確至0.01 mg）用乙酸乙酯溶解、定容，配制成質量濃度1.0 mg/mL儲備液，于-18 ℃避光保存備用。使用時用乙酸乙酯稀釋成質量濃度10，20，50，100，200和500 μg/L的系列標準工作液，臨用現配。

1.2.2 樣品前處理

將石斑魚、鱖魚、南美白對蝦等樣品取肌肉部分，用勻漿機絞碎混勻，于-18 ℃以下條件冷凍保存備用，使用時取出自然解凍 。

提取：稱取2 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，加入2 mL超純水和1顆均質子，旋渦振蕩1 min，加入10 mL乙腈，旋渦振蕩5 min后超聲提取10 min，加入2 g氯化鈉（NaCl）手搖1 min，以5 000 r/min離心10 min，上清液轉移至另1支50 mL離心管中；加入10 mL乙腈重復提取1次，合并乙腈提取液，加入2 g無水硫酸鎂（MgSO4），劇烈振搖1 min，以5 000 r/min離心5 min，上清液轉移至50 mL雞心瓶中，40 ℃旋轉蒸發至近干，3 mL正己烷復溶待凈化。

凈化：依次使用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷活化Silica固相萃取柱，將復溶液全部轉移至固相萃取柱中，用3 mL正己烷潤洗雞心瓶，全部倒入固相萃取柱中，依靠重力自然流出。用5 mL正己烷淋洗固相萃取柱，棄掉全部流出液，用5 mL乙酸乙酯洗脫并收集，40 ℃水浴氮吹至體積小于2 mL，再用乙酸乙酯定容至2 mL供GC-MS分析。

1.2.3 氣相色譜-質譜條件

1) 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度230 ℃。升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至280 ℃保持17 min。載氣，高純氦氣（純度≥99.999%）；總流量35 mL/min；恒壓模式90 kPa；進樣模式，不分流模式；進樣量1 μL。

2) 質譜條件

離子源溫度230 ℃；接口溫度260 ℃；電離方式，電子轟擊源（EI）；電離能量70 eV；溶劑延遲5 min；檢測方式，選擇離子監測（SIM）模式。在上述條件下喹哪啶標準溶液總離子流圖見圖1，喹哪啶保留時間、定量和定性離子及豐度比見表1。

表1 喹哪啶的保留時間以及定量、定性離子

圖1 喹哪啶標準溶液SIM模式下總離子流圖（50 μg/L）

2 結果與討論

2.1 分析條件選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

試驗考察SH-RTx-5MS、DB-5MS、DB-17MS這3種色譜柱對喹哪啶的分離效果（見圖2）。采用SHRTx-5MS色譜柱時，目標物出峰時間較早，噪音較大，基線不穩，峰形較差，拖尾嚴重；采用DB-5MS色譜柱時，出峰時間稍晚，雖基線和峰形均有所改善，但仍有拖尾現象；采用DB-17MS色譜柱時，目標物質出峰時間較理想，分離效果好，基線平穩，峰形尖銳。因此，選擇DB-17MS色譜柱為分析柱。

圖2 不同色譜柱對喹哪啶分離效果的影響

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

試驗選擇乙腈、乙腈+乙酸乙酯（1∶1，V/V）、正己烷+丙酮（3∶1，V/V）、正己烷4種有機溶劑作為提取溶劑，考察其對水產品中喹哪啶的提取效果。稱取2 g水產品（石斑魚）空白樣品于50 mL離心管中，添加250 μg/kg喹哪啶標準溶液，分別使用4種溶劑進行提取，提取液定容至20 mL，上機測定（總離子流見圖3）并計算回收率，每種提取溶劑設置3組平行試驗。

圖3 不同提取溶劑對喹哪啶的提取效果

結果顯示，正己烷+丙酮（3∶1，V/V）和正己烷作為提取溶劑時，雖回收率均≥120%，但雜質較多，后期凈化難度大，對儀器和色譜柱影響和傷害也較大。乙腈和乙腈+乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為提取溶劑時，回收率為95%~100%，提取效果無明顯差別，但乙腈+乙酸乙酯（1∶1，V/V）作為提取溶劑時，回收率不穩定，因此試驗選擇乙腈作為提取溶劑。在提取時加入均質子輔助，振蕩過程中進一步混勻樣品，增大提取效果。同時在提取溶液中加入NaCl促進水相和有機相分離，不僅減輕后續凈化過程的除水壓力，還增大待測組分在乙腈相中的分配比，提取效果更好。

2.2.2 固相萃取柱的選擇

水產品樣品基質較復雜，提取液需經凈化處理才可上機測定。固相萃取法是試驗室最為常用的凈化方式，其操作簡單，凈化效果較好[17]。試驗稱取2 g水產品（石斑魚）空白樣品中，加入50 μg/kg喹哪啶標準溶液，按照1.2.2進行提取后，分別擬采用NH2柱、Florisil柱、Silica柱、PSA柱、Phenyl柱、GCB柱[18-19]6種固相萃取柱凈化喹哪啶提取液，上機測定并計算和比較加標回收率。每種固相萃取柱設置3組平行試驗，不同固相萃取柱凈化后的回收率的比較見圖4。

圖4 不同類型固相萃取柱對喹哪啶加標回收率的影響

6種不同固相萃取柱的回收率差異較大，其中NH2柱、Florisil柱、PSA柱、Phenyl柱4種柱子凈化效果略差，回收率均≤70%；GCB柱和Silica柱2種柱子凈化效果較好，回收率均≥88%。但GCB柱凈化時用乙腈-甲苯混合洗脫，甲苯毒性大，氮吹時間較長。綜合考慮試驗成本、試劑毒性、試驗時長等多方面因素，故最終選擇Silica柱作為凈化固相萃取柱。

2.2.3 洗脫溶劑體積的選擇

考察乙酸乙酯作為洗脫溶劑時，洗脫溶劑體積對喹哪啶回收率的影響。選擇3，4，5，6，7和8 mL的6組不同洗脫溶劑體積，每組進行3次重復試驗。結果顯示，洗脫溶劑體積3 mL時，回收率為55%~65%；隨著洗脫溶劑體積增加，回收率有所提高，洗脫溶劑體積5 mL時，回收率為88%~95%；但洗脫溶劑體積＞5 mL時，回收率沒有明顯增加。因此，考慮到節約成本和避免水浴氮吹時間太長，試驗選擇5 mL乙酸乙酯作為洗脫溶劑。

2.3 方法線性范圍、檢出限和定量限

將1.2.1配制的質量濃度分別為10，20，50，100，200和500 μg/L系列標準溶液按照1.2.3條件進行分析，以標準溶液的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，以峰的面積（y）為縱坐標，建立線性回歸方程為y=745.54x+3 324.08。結果表明，喹哪啶在10~500 μg/L范圍內，線性關系良好，相關系數為0.999 5。根據相關文獻[20]，以3倍信噪比（S/N≥3）計算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）計算方法定量限（LOQ），同時結合儀器實際響應情況，計算得喹哪啶的方法檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg。

2.4 加標回收率和精密度

空白南美白對蝦、石斑魚、鱖魚肌肉樣品中分別添加20，40和200 μg/kg喹哪啶標準溶液，每個濃度設置6個平行同時設置1個空白對照，按照1.2.2進行提取、凈化、上機測定，計算喹哪啶的加標回收率及相對標準偏差（SRSD），結果見表2。結果顯示，喹哪啶平均加標回收率為80.0%~98.2%；相對標準偏差（SRSD）為3.3%~11.5%，表明試驗方法回收率較好，重復性高，符合殘留分析要求[21]。

表2 加標樣品的回收率和精密度（n=6）

空白石斑魚樣品和石斑魚加標樣品SIM模式下總離子流圖見圖5。

圖5 空白和加標石斑魚在SIM模式下總離子流圖

2.5 實際樣品測定

采用建立的方法對湛江某水產品批發市場隨機購買的10份水產品樣品進行檢測，結果顯示所有樣品均未檢出喹哪啶。

3 結論

建立氣相色譜-質譜聯用儀測定水產品中喹哪啶麻醉劑殘留的檢測方法，其檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg，平均回收率為80.0%~98.2%；相對標準偏差為3.3%~11.5%。該方法簡單快捷，檢測成本低，回收率高，重現性好，適合用于水產品中喹哪啶麻醉劑殘留的測定。