不同溫度對香蕉果實丙二醛，呼吸速率和能量代謝影響

李朋超，孟陸麗，程謙偉*，胡波，楊菊，張萌

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

香蕉果實不僅營養(yǎng)成分豐富，而且所含的酚類化合物在降低患心血管疾病和癌癥風(fēng)險上有明顯的作用，因此在國際市場上有很高的需求[1-5]。香蕉作為一種呼吸躍變型的熱帶水果，在常溫下貯藏6~8 d后果肉快速軟化，果皮變黃，使其具有較短的保質(zhì)期[6-7]。低溫存儲已成為延緩果蔬成熟和延長果蔬貯藏期的最有效技術(shù)之一[8]。然而，香蕉果實和其他熱帶果實一樣，對低溫很敏感易發(fā)生冷害[9]。香蕉果實的冷害癥狀包括果皮快速褐變、發(fā)黑、點蝕和成熟異常，這大大降低了商品質(zhì)量和消費者的接受度[10]。

能量是生命活動的基礎(chǔ)，生物的所有生理活動都需要能量。越來越多的研究表明，水果的某些生理失調(diào)，包括褐變和冷害，可能與細胞能量水平的降低有關(guān)[11-12]。長期冷藏可能導(dǎo)致采后果實的ATP和能荷（EC）降低，從而導(dǎo)致能量代謝紊亂[13]。近年來有研究者對枇杷果、竹筍、黃瓜、桃、梨、芒果冷害與能量狀態(tài)的關(guān)系進行了研究[14-20]。

目前，尚未有研究報道香蕉果實在不同溫度儲存中冷害發(fā)生程度與能量水平之間的變化。因此，試驗分別對在25，13和5 ℃儲存條件下香蕉果實的冷害指數(shù)、相對電導(dǎo)率、丙二醛、呼吸速率、表皮細胞結(jié)構(gòu)和能量水平進行了研究，揭示香蕉果實冷害發(fā)生的機理，旨在為香蕉果實采后冷藏保鮮技術(shù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水果材料和試驗設(shè)計

香蕉購買產(chǎn)于廣西南寧的高樂品種，采收期在5~6月。為減小誤差，選擇樣品在成熟度（未成熟）、顏色（淺綠色）、形狀和大小方面相似，并且沒有瑕疵和外部缺陷的香蕉果實隨機分為3組（每組30支），分別儲存在25，13和5 ℃和相對濕度為85%的條件下，用于相關(guān)生理指標(biāo)的測定。另外單獨取45支香蕉，隨機分為3組，每組15支（即每個溫度15支香蕉），用于呼吸速率的測定。在貯藏期間每隔3 d采集一次樣本。此外，由于冷害過程會產(chǎn)生褐變，為更準確對香蕉冷害分級，使用1.2圖像處理裝置。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；圖像處理系統(tǒng)（自制）；FA-2104N型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；H3-18KR高速臺式冷凍離心機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；日立S-3400N掃描電鏡（日立日本技術(shù)公司）；DDS-11A相對電導(dǎo)率儀（上海虹益儀器儀表有限公司）；TU-1950型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.3 香蕉圖像采集系統(tǒng)

將香蕉樣品放在裝置托盤，數(shù)碼相機安裝在托盤上方約30 cm處，使用分辨率為600×400像素的數(shù)碼相機（MER-503-36U3C，大恒水星，中國，北京）進行成像，圖像以BMP格式保存。使用Matlab R2014a（Mathworks，美國）進行圖像處理。采集裝置如圖1所示。

圖1 系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)圖

1.4 香蕉的圖像處理

香蕉表皮上的黑斑多呈黑色或深褐色，色彩偏暗片深；而正常香蕉通常呈黃色或綠色，顏色不深，并且香蕉拍攝箱體為鋁合金板，在箱內(nèi)光源照射下，背景偏白且亮度較高。因此，可以采用亮度特征將香蕉黑斑從圖像中分割出來。香蕉圖像中每一個像素點用R、G、B三個值表示其顏色，通過式（1），將每個像素點的顏色轉(zhuǎn)化為一定的灰度值Y，從而將彩色圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像。

此外，通過巴特沃思濾波器對圖像進行預(yù)處理，消除例如圖像直方圖均衡化和圖像傳輸引起的噪聲的預(yù)處理操作。然后，通過執(zhí)行Otsu自適應(yīng)閾值方法提取閾值，對香蕉圖像進行圖像分割[21]。分割后的二值化圖像，黑色的像素點的區(qū)域?qū)?yīng)于香蕉的褐變區(qū)域，白色區(qū)域表示背景。

參考已有的圖像特征提取方法，采用分割后二值區(qū)域像素點的個數(shù)表示香蕉圖像的褐變面積。

1.5 冷害指數(shù)的測定

參考Yang等[22]的方法，并稍作修改。冷害程度分為5個等級，由褐變指數(shù)等級代替。褐變指數(shù)等級：0=無褐變；1=褐變面積＜25%；2=褐變面積25%~50%；3=褐變面積50%~75%；4=褐變面積大雨75%。冷害指數(shù)按式（2）計算。此處采用的褐變面積為圖像采集到的由冷害引起的褐變面積。

1.6 呼吸速率的測定和掃描電鏡

呼吸速率根據(jù)Chen等[23]的方法并稍作修改。呼吸速率的單位為mg CO2·kg-1·h-1。

參考Guo等[24]的方法，并稍作修改。用水沖洗除去果表的灰塵等異物。用雙刃刀片切取長、寬約為3 mm×2 mm的果皮數(shù)塊，投入0.1 mol/L PBS配制的2.5%pH 6.8的戊二醛溶液中，在4 ℃條件下固定24 h，固定好后的樣品用0.01 mol/L的磷酸緩沖液漂洗3次。采用梯度叔丁醇分5級脫水，用體積分數(shù)為100%的叔丁醇浸沒30 min，置于真空冷凍干燥機48 h，之后用電導(dǎo)膠把果皮粘貼在樣品臺上，粘貼時樣品觀察面朝上。用鍍膜儀鍍金膜，置于掃描電子顯微鏡（SEM）于5 kV加速電壓下觀察拍片。

1.7 相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量的測定

參考Yang等[25]的方法，并稍作修改。用直徑10 mm的打孔器取下10個果皮，蒸餾水清洗3次，用濾紙吸干，將果皮置于試管，加入20 mL去離子水，浸泡30 min測定溶液的初始電導(dǎo)率C0；再將大試管放到沸水浴中30 min，快速冷卻，測定溶液的電導(dǎo)率C1。相對電導(dǎo)率以煮沸前后的相對電導(dǎo)率比值表示。

參考Zhang等[26]的方法，并稍作修改。稱取1.0 g果皮樣品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，研磨勻漿，按10 000 r/min離心15 min，收集上清液。取2.0 mL上清液（對照空白管中加入2.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液代替提取液），加入2.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混勻后在沸水浴中20 min，取出冷卻后離心。取上清液分別測定A450，A532和A600的吸光度。結(jié)果以μmol/g表示。

1.8 ATP，ADP和AMP含量和能荷（EC）的測定

參考Lin等[27]的方法，并稍作修改。取2.0 g果皮加入預(yù)冷的5 mL 0.6 mol/L高氯酸研磨后提取20 min，于4 ℃下，以12 000 r/min離心15 min。取3 mL上清液，用1 mol/L KOH將pH調(diào)至6.5~6.8，定容稀釋到4 mL后用0.45 μm微孔濾膜過濾。ATP、ADP、AMP含量采用安捷倫1260高效液相色譜測定，分析柱采用C18反相柱（250 mm×4.6 mm，phenomenex，Luna，LC），二極管陣列檢測器，測定波長為254 nm，進樣體積20 μL，流速0.8 mL/min。流動相A為磷酸鹽緩沖液，包含0.03 mol/L K2HPO4和0.02 mol/L KH2PO4，用0.1 mol/L KOH調(diào)節(jié)至pH 7.0，流動相B為甲醇。采用梯度洗脫，條件為0 min，100% A；7 min 80∶20（A∶B）；9 min，75∶25（A∶B）；10 min 100% A。最后延遲5 min恢復(fù)基線平衡。ATP、ADP、AMP含量通過外標(biāo)法與標(biāo)準樣品進行比對。AXP=ATP+ADP+AMP。按式（3）EC計算。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，Duncan多重范圍檢驗確定均值之間的差異（p＜0.05）。試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同儲存溫度下香蕉果實冷害指數(shù)的變化

冷害是指0 ℃以上的不適低溫對冷敏性果蔬在低溫脅迫下造成的一種不良反應(yīng)。從表1可以看出，在整個儲藏階段，5 ℃儲存條件下香蕉果實從第3天開始出現(xiàn)冷害癥狀，表皮出現(xiàn)輕微的水漬狀斑點，此時冷害指數(shù)為11.1%；隨著儲存時間的增加冷害程度加重，貯藏12 d時香蕉果實冷害癥狀表現(xiàn)嚴重，并且伴隨出現(xiàn)水漬，斑點等癥狀，此時冷害指數(shù)為96.3%；13 ℃儲存條件下香蕉果實在第9天出現(xiàn)輕微冷害癥狀，伴隨根部果皮顏色發(fā)黑，此時冷害指數(shù)為6.3%；而25 ℃儲存條件下的香蕉果實未發(fā)生冷害，但貯藏12 d時果實已經(jīng)出現(xiàn)輕微腐爛。

表1 不同貯存溫度下香蕉果實的冷害指數(shù)

2.2 不同儲存溫度下香蕉果實呼吸速率和表皮結(jié)構(gòu)的變化

如圖2所示，不同儲存溫度下的香蕉果實在儲存初期呼吸速率降低，可能是適應(yīng)新環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)；儲存中期呼吸速率升高，可能是香蕉果實出現(xiàn)呼吸躍變，Lin等[28]對桂圓果實和Chen等[29]對龍眼果實的研究中也出現(xiàn)呼吸躍變。此外，由圖2可知，低溫貯藏沒有推遲呼吸躍變的出現(xiàn)。5 ℃儲存條件下香蕉果實的呼吸速率顯著低于13 ℃和25 ℃儲存條件下的呼吸速率，這一結(jié)論與蘇新國等[30]對香蕉果實的研究結(jié)果相似，這表明低溫會抑制香蕉的呼吸作用。

圖2 不同的儲存溫度下香蕉果實的呼吸速率

掃描電鏡觀察表明（圖3），在貯藏初期（第0天），香蕉果皮沒有冷害，表皮細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞飽滿，排列整齊有序，表面光滑無皺紋和裂紋，結(jié)構(gòu)清晰，氣孔開放程度較?。ˋ1，A2，A3）；在貯藏中期（第6天），5 ℃儲存條件下果實發(fā)生中度冷害，表皮細胞收縮，有序性下降（B1），25 ℃和13 ℃儲存條件下表皮出現(xiàn)輕微的皺紋和裂紋，氣孔開放程度變大（B2，B3）；在儲存后期（第12天），5 ℃儲存條件下香蕉果實冷害變得非常嚴重，表皮細胞結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，細胞皺縮（C1），25 ℃和13 ℃儲存條件下香蕉果實表皮分裂成唇狀突起形成皮孔，并且裂紋的長度和寬度增加，氣孔收縮（C2，C3）。此外，在儲藏初期氣孔開放程度較小，儲藏中期氣孔開放程度變大，儲藏后期氣孔收縮的現(xiàn)象與呼吸速率變化趨勢一致。

圖3 香蕉在儲存過程的掃描電子顯微鏡圖像

2.3 不同儲存溫度下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化

冷害是造成細胞膜損傷的主要原因之一，相對電導(dǎo)率可反映果皮細胞膜的破壞程度。果蔬發(fā)生冷害時，細胞膜的通透性會增加甚至完全喪失，膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，相對電導(dǎo)率變大，膜脂過氧化程度加劇，而相對電導(dǎo)率越大，則細胞膜的完整性破壞越嚴重[31]。如圖4所示，25 ℃貯藏條件下香蕉果皮電導(dǎo)率從第6天開始顯著升高，此時香蕉的外觀表現(xiàn)出黃化、伴隨褐變斑點出現(xiàn)，這可能是貯藏過程中果皮的衰老導(dǎo)致相對電導(dǎo)率升高[32]；13 ℃貯藏條件下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率處于較低水平；5 ℃貯藏條件下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率變化趨勢顯著，在第12天增加74%，這可能是冷害引起了細胞膜損傷，致使電解質(zhì)外滲[33]。

圖4 不同的儲存溫度下香蕉果皮的相對電導(dǎo)率

ATP缺乏會誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，MDA作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量常用來表示果蔬衰老或冷害過程中細胞膜的膜脂過氧化程度和逆境傷害程度[34-35]。從圖5可以看出，5 ℃儲存條件下香蕉果皮的MDA含量顯著高于其他兩個儲存條件下（p＜0.05），這可能是冷藏導(dǎo)致香蕉果皮的ATP和EC降低，從而導(dǎo)致能量代謝紊亂的結(jié)果[36]；13 ℃儲存條件下的MDA含量緩慢上升，這可能是充足的ATP和EC供應(yīng)保護膜完整性的結(jié)果[34]；而25 ℃儲存條件下香蕉果皮MDA含量在儲藏后期上升，可能是由于貯藏溫度較高，促使了膜脂過氧化反應(yīng)速率加快。

圖5 不同的儲存溫度下香蕉果皮的丙二醛

2.4 不同儲存溫度下香蕉果皮ATP、ADP、AMP和能荷的變化

不同的儲存溫度下香蕉果皮ATP（D1），ADP（D2），AMP（D3），AXP（D4）含量和能量電荷（D5）如圖6所示。能量是生命活動的基礎(chǔ)，能量狀態(tài)與生物學(xué)特性密切相關(guān)[37]。一般而言，無論儲存溫度的高低，果蔬的ATP和ADP含量均出現(xiàn)隨儲存時間的增加而逐漸降低的趨勢[6]。如圖6所示，在儲存前期，香蕉果皮的ATP，ADP和EC含量較高（D1，D2，D5），而磷酸腺苷（AMP）的含量相對較低（D3）；隨著儲存時間的增加，ATP，ADP和EC的含量降低，AMP的含量增加。5 ℃儲存條件下香蕉果皮的ATP和ADP含量的下降幅度明顯高于其他組（p＜0.05），在第12天，5 ℃儲存的果皮顯示出最低的ATP和ADP含量，這一趨勢與Chen等[38]對桃果實的研究得到相似的結(jié)果；13 ℃儲存條件下香蕉果皮的ATP和ADP含量的顯著高于其他組（p＜0.05），在第12天儲存結(jié)束時，13 ℃儲存條件下香蕉果皮顯示出最高的ATP和ADP含量。

圖6

此外，隨著溫度的降低和保存時間的延長，5 ℃儲存條件下香蕉果皮總腺苷核苷酸顯著減少（p＜0.05）。因此，低溫不僅減少了香蕉果皮中的EC數(shù)量，而且由于總腺嘌呤核苷酸的減少導(dǎo)致ATP的數(shù)量的減少，可能進一步加劇香蕉果皮冷害癥狀[6]。

3 結(jié)論

5 ℃下的香蕉果實 ATP、ADP含量和EC值最低，呼吸速率最低，細胞能量虧缺最嚴重，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量最高，其存在典型的凍害癥狀，如褐變，水漬斑點和凹陷。13 ℃貯藏香蕉果實保持最高的能量水平，呼吸速率較高，相對電導(dǎo)率和丙二醛含量最較低，在第9天出現(xiàn)冷害癥狀。表明香蕉果實冷害發(fā)生與能量虧缺有密切關(guān)系，較高的能量水平有助于減輕冷害。