藍莓多酚在發酵酸奶貯藏期穩定性研究

許尨 *，高鵬，馬海然 ，李洪亮

1. 內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）；2. 蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司（北京 101100）；3. 內蒙古自治區乳品與奶牛繁育生物工程技術企業重點實驗室（呼和浩特 011500）

隨著消費者對于健康安全飲食的關注和認知的提升，關于酸奶單獨的營養價值和生理功效研究逐漸增多，同時富含多酚類的果蔬植物也開始進入消費者視野，針對植物資源的功能性研究逐漸熱門，抗氧化的評價、促進胃腸道健康、消化吸收、提高生理功能及一定保健作用成為營養學研究熱點[1]。

藍莓為杜鵑花科越橘屬多年生低灌木，原產地為北美洲與東亞地區。果實中含有豐富的營養成分，主要以花青素等多酚類物質為主，它不僅具有良好的營養保健作用，還具有防止腦神經老化、強心、抗癌、軟化血管、增強人體免疫、抗衰老、抑制有害菌等功能[2]。藍莓因具有較強的抗氧化活性及在產品中的應用，不斷被中國消費者認可接納，伴隨功能性食品開發流行趨勢，將藍莓與酸奶、牛奶等進行組合開發復合乳制品，提高乳產品的綜合功能性和營養價值。但針對藍莓酸奶產品的主要研究集中在產品風味、質構、產品開發工藝設計優化等方面，對于藍莓酸奶中含有的多酚類物質的穩定性及共存營養組分對產品抗氧化能力和吸收利用的研究較少。多酚類物質的穩定性受產品儲存溫度、產品最終pH、獨立產品包裝的內部含氧量，以及產品體系中穩定劑種類和蛋白、脂肪組分含量的影響，多酚類物質在貯藏期內穩定性和生物利用率能否保持穩定，對于藍莓乳產品的開發有一定影響[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）；甲醇（天津市東麗區天大化學試劑廠）；連苯三酚（天津市光復精細化工研究所）；碳酸鈉（天津市東麗區天大化學試劑廠）；凝乳酶（美國Sigma公司）。

721型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；GL-21M高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；FE20實驗室pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；總糖度折光旋光儀（日本ATAGO愛拓）；hz-82震蕩型恒溫水浴鍋（金壇新航有限公司）；WB2000-D數字式攪拌器（德國WIGGENS公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍莓果漿樣品制備

速凍藍莓顆粒，常溫下水浴溶解6 h，完全解凍后，攪拌器內粉碎攪拌至果漿溶液，經0.150 mm孔徑篩過濾，保留過濾溶液，水浴攪拌加熱，在90 ℃、5 min條件巴殺滅菌，迅速冷卻降溫后，果漿濾液備用[4]。

1.2.2 發酵酸奶制備

稱取一定量純牛奶，將白砂糖與穩定劑攪拌混勻，化料，過均質機均質，巴氏殺菌冷卻接入發酵菌種，于42 ℃發酵至pH 4.6后熟，破乳、冷卻、二次巴氏殺菌，待裝。

藍莓全脂酸奶，化料后，加入濃度15%的藍莓果漿攪拌，均質，后續流程同上。

1.2.3 滴定酸度的測定

按GB 5413.34—2010中規定方法執行。

1.2.4 總固形物含量的測定

按GB 5413.39—2010中規定方法執行。

1.2.5 多酚的提取

取10 g藍莓酸奶置于50 mL離心管中，加15 mL酸化甲醇（含0.05 mL濃鹽酸）有機溶劑，按10 000 r/min剪切提取1 min，于-20 ℃靜置30 min以使蛋白充分沉淀，按8 000 r/min、4 ℃離心15 min，上清液經0.22 μm 濾膜過濾并用于多酚類物質含量及抗氧化活性的測定。3 g藍莓果料與7 g去離子水混勻并作為藍莓果料的提取樣，8 g酸奶樣品與2 g去離子水混勻并作為各酸奶對照的提取樣，其他提取步驟同藍莓酸奶[5]。

1.2.6 多酚含量的測定

1.2.6.1 溶液配制

制備0.25 mol/L福林酚試劑，取2 mL原濃度福林酚試劑（2 mol/L）和14 mL蒸餾水，均勻混合。

制備15% Na2CO3溶液，取3 g Na2CO3·10 H2O溶于20 mL蒸餾水中。

連苯三酚標準溶液制備，準確稱取10 mg連苯三酚標標準品，用甲醇溶液定容至50 mL，獲得0.2 mg/mL連苯三酚標準溶液。

1.2.6.2 樣品溶液制備

移取0.3 mL提取液于試管中，先加入0.3 mL福林酚試劑，充分混勻并靜置5 min，加入3 mL Na2CO3溶液，混勻并靜置10 min，用6.4 mL去離子水定容至10 mL，于50 ℃避光水浴8 min，在波長750 nm處讀取吸光度。以連苯三酚（0.025~0.25 mg/mL）為標準品作標準曲線，結果用連苯三酚當量表示（mg/100 g提取樣）[6]。

1.2.7 貯藏期內酸奶抗氧化活性測定

1.2.7.1 貯藏期內酸奶總抗氧化活力測定

取0.3 mL提取液，加0.7 mL甲醇稀釋，依次加入0.2 mL 1 mol/L HCl溶液、1.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 1%的SDS溶液和0.5 mL 0.2%的FeCl3溶液，混勻并用6.3 mL去離子水定容到10 mL，室溫靜置30 min，立即在750 nm處測吸光度。以VC（0.04~0.18 mg/mL）為陽性對照作標準曲線，結果用VC當量表示（mg/100 g提取樣）[7]。

1.2.7.2 貯藏期內酸奶ABTS自由基清除能力測定

6.4 mmol/L ABTS和3.6 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，避光靜置12 h，作為ABTS+自由基儲備液，使用前將儲備液用pH 7.4醋酸鹽緩沖液稀釋，使其A734nm落在0.7±0.02范圍內，即為工作液。在0.04 mL提取液中加入3 mL ABTS+工作液，避光靜置6 min，測其A734nm，并計算清除率。以VC（0.02~0.12 mg/mL）為陽性對照作標準曲線，結果用VC當量表示（mg/100 g提取樣）[8]。

2 結果與分析

2.1 酸奶基本成分分析

酸奶樣品的基礎組分分析見表1。結果表明，添加藍莓果漿的藍莓全脂酸奶相比全脂酸奶對照的總固體含量、脂肪、蛋白質和酸度均有所提升（p＜0.05），同時其pH降低（p＜0.05），這是由于藍莓果漿本身果汁呈低酸性。發酵酸奶樣品的理化指標均符合GB 19302—2010的理化指標要求，符合開展加速貯藏試驗的要求[9]。

表1 酸奶基本成分分析

2.2 藍莓酸奶貯藏期多酚含量測定

以連苯三酚為標準品建立總酚質量濃度與吸光度間的關系，結果如圖1所示，得標準曲線方程y=2.071 8x+0.088 0（R2=0.999 93），線性關系良好，可用于各樣品中總酚含量的測定。

圖1 連苯三酚標準曲線

貯藏期間各樣品的總酚含量變化如圖2所示。藍莓全脂酸奶的總酚含量在1~21 d均呈下降趨勢（p＜0.05），分別從55.74±1.28 mg/100 g降至47.68±0.9 mg/100 g，21~28 d則保持相對穩定，到28 d貯藏期結束時，藍莓酸奶總酚含量無顯著差異（p＞0.05），分別較初期水平降低14.65%[10]。全脂酸奶降幅不明顯；藍莓果漿的總酚含量在第14天達到最大值，為74.72±1.64 mg/100 g，到貯藏期結束時與初期水平相比降低0.87%（p＞0.05）。

圖2 貯藏期內樣品多酚含量變化

結果表明，貯藏期間全脂酸奶、藍莓全脂酸奶的總酚含量變化差別不顯著（p＞0.05），但兩者的總酚含量及穩定性均低于藍莓果漿[11]。

2.3 藍莓酸奶貯藏期抗氧化能力變化

2.3.1 貯藏期內酸奶總抗氧化活力測定

以VC為標準品建立VC質量濃度與吸光度間的關系，結果如圖3所示，得標準曲線方程為y=5.172 9x-0.004 4（R2=0.999 4），線性關系良好，可用于各樣品中總抗氧化活力的測定。圖4所示為各樣品在貯藏期間的總抗氧化活力變化。

圖3 VC質量濃度與總抗氧化活力標準曲線

圖4 貯藏期內各樣品抗氧化活力變化

分析樣品的變化趨勢可得，藍莓全脂酸奶的總抗氧化活力在1~14 d呈緩慢下降趨勢，從（45.81±1.47）mg/100 g降至（42.06±0.84）mg/100 g（p＜0.05），14~28 d呈上升趨勢，兩階段漲幅分別為2.52%和3.20%，全脂酸奶的降幅比較明顯，從24.77±0.9 mg/100 g降至18.56±1.61 mg/100 g；藍莓果漿的總抗氧化活力在第7天最大，為62.82±0.96 mg/100 g，到28 d結束時較初期降低0.58%，變化不顯著（p＞0.05）。

結果表明，藍莓果漿的添加雖然大幅提高酸奶對照的抗氧化活性，但與酸奶混合導致果漿的總抗氧化活力明顯降低，造成這種現象可能是藍莓酸奶中游離態酚類物質含量低于藍莓果漿；酸奶體系中的脂肪含量也會對藍莓果漿的抗氧化活力造成影響[12-13]。

2.3.2 貯藏期內酸奶ABTS自由基清除能力測定

以VC為標準品建立VC質量濃度與ABTS+自由基清除率之間的關系，如圖5所示，得回歸方程y=1.010 6x+0.004 9（R2=0.999 1）。各樣品在貯藏期間的ABTS+自由基清除能力變化如圖6所示。

圖5 VC質量濃度與ABTS+自由基清除率標準曲線

由圖6可知，藍莓全脂酸奶的ABTS+自由基清除能力顯著降低，分別從71.39±1.07 mg/100 g降至52.71±1.7 mg/100 g（p＜0.05），貯藏期降幅為26.1%，全酸奶的降幅較小，變化不顯著；藍莓果漿的ABTS+自由基清除能力在第7天達到最大值，為93.36±1.24 mg/100 g，貯藏末期較初期降低不顯著（p＞0.05），降幅為1.29%。

圖6 貯藏期內樣品ABTS+自由基清除能力變化

結果表明，藍莓全脂酸奶的多酚-蛋白結合作用使得體系中能夠參與自由基清除的游離態多酚物質含量降低，導致藍莓酸奶的總抗氧化活力和ABTS+自由基清除能力均低于藍莓果漿[14-15]。

2.4 藍莓酸奶貯藏期顏色變化

全脂酸奶和藍莓全脂酸奶之間亮度的顯著變化可能是由于藍莓果漿中存在的游離多酚和花青素導致光分子的吸收受到影響，同時在全脂酸奶28 d儲存期間，L*值的降低是由于乳蛋白分子間和分子內反應，導致光反射減少[16-17]。

a*（紅度）值的提升可能是由于藍莓果漿中存在的花青素，使藍莓全脂酸奶中呈現紫色。此外，藍莓果漿樣品的a*值在儲存期內有所下降，在常溫儲存條件下貯藏21 d之前保持穩定，表明花青素氧化過程緩慢進行，藍莓全脂酸奶樣品a*值的降低可能是由于體系內部游離的花青素隨著時間的增加不斷與體系中可氧化部分進行絡合，花青素逐漸減少，整體顏色不斷改變[18]。

b*（黃度）值受添加藍莓果漿的影響，所以藍莓全脂酸奶比全脂酸奶表現出更高的b*值，并且在儲藏期內沒有差異（p＞0.05）[19]。

表2 各樣品貯藏期內顏色變化

3 結論

通過試驗和數據分析，試驗發現添加藍莓果漿的酸奶較全脂酸奶相比在整體多酚含量、抗氧化能力和ABTS清除自由基能力上有顯著提升，雖然藍莓全脂酸奶、全脂酸奶體系降低藍莓果漿總多酚物質的含量和穩定性，抗氧化能力也有所降低，但整體通過添加藍莓果漿可提升全脂酸奶的營養價值和生物利用性[20]。