蜂蜜中揮發性化合物萃取分析技術的研究進展

劉歡，李亮

1. 上海工微所科技有限公司（上海 200233）；2. 上海冠生園蜂制品有限公司（上海 201419）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1]。蜂蜜氣味香甜、口感潤滑并且具有較高的營養價值。蜂蜜風味能夠直觀地反映出蜂蜜的品質特性，而其特有風味的形成依賴于多種揮發性化合物的協同作用，尤其是一些氣味閾值較低的化合物。目前蜂蜜中揮發性化合物的研究方法已較為成熟。揮發性化合物被從蜂蜜中萃取出來后，通常運用配有檢測器的氣相色譜儀（Gas chromatography，GC）進行化合物的分離鑒定，或者運用感官分析對蜂蜜風味進行具體描述[2]。萃取分析直接影響蜂蜜中揮發性成分的提取效率和鑒定結果，是后續進行蜂蜜分析和評價的基礎。主要從萃取分析技術等方面綜述近年來蜂蜜中揮發性化合物的研究成果，旨在為蜂蜜揮發性化合物的研究提供理論參考。

1 萃取技術

溶劑萃取和頂空萃取是分析揮發性化合物常用的萃取技術。溶劑萃取使用有機溶劑萃取蜂蜜中的揮發性成分，操作繁瑣且容易造成環境污染。頂空萃取則避免了有機溶劑的使用。

1.1 溶劑萃取

液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）是最基本的溶劑萃取技術，非極性或弱極性的二氯甲烷[2]和乙醚[3]等有機溶劑通常用來萃取蜂蜜中的揮發性化合物。同時蒸餾萃取（Simultaneous steam distillation-solvent extraction，SDE）和超聲波輔助萃取（Ultrasoundassisted extraction，USE）則是在LLE的基礎上分別結合水蒸餾法和超聲波法，以提高萃取效率。王興龍等[4]分別利用LLE、SDE和USE方法萃取油菜蜜中揮發性成分。結果顯示，LLE結果中的化合物數量最少（28種），SDE和USE則分別有36種和48種。但是，這3種方法對樣品的多次重復萃取，造成有機溶劑使用量的增加[3,5]。固相萃取（Solid phase extraction，SPE）可以集樣品凈化和富集于一體，首先使用預處理后的萃取柱吸附蜂蜜中的目標化合物，然后使用少量的有機溶劑洗脫。萃取柱中填充的吸附材料種類多樣，梁芳慧等[3]對比分析了HLB柱、LC-C18柱和LC-C4柱對蜂蜜中揮發性成分的萃取效果。結果顯示，親水性HLB柱萃取到47種化合物，基本涵蓋了LC-C18柱和LC-C4柱萃取的化合物。Jasicka-Misiak等[6]在分析菊科蜜時使用的是SDBL柱；Uckun等[2]分析柑橘和黃芪蜜時使用的是OASIS柱。

1.2 頂空萃取

頂空萃取是分析揮發性化合物常用的方法，在密閉的容器中，一定溫度下化合物從蜂蜜中揮發出來后被捕集裝置捕獲。捕集裝置可以是氣體針、填充或涂覆有吸附材料的吸附管、不銹鋼絲或者攪拌棒等。靜態頂空（Static headspace extraction，SHS）是利用氣體進樣針抽取蜂蜜上方氣體并直接進樣到GC中的技術。Arroyo-Manzanares等[7]鑒定蜂蜜摻假時，稱取1 g蜂蜜放入20 mL頂空瓶并最終抽取750 μL氣體進行檢測。王文靜等[8]判別蜂蜜蜜源時，稱取13 g蜂蜜并且進樣體積為1 mL。動態頂空（Dynamic headspace extraction，DHS）又叫吹掃捕集，其利用大流量高純氣體吹掃蜂蜜上方氣體，同時填充有多孔聚合物的吸附管（通常為Tenax TA）選擇性地吸附揮發性化合物[9]。Escriche等[10]運用DHS分析薰衣草蜜和百里香蜜時，使用100 mL/min的氮氣吹掃樣品并使用Tenax TA吸附管捕集揮發性成分。Patrignani等[11]則使用30 mL/min的氦氣吹掃阿根廷蜂蜜。

固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）是將涂覆有吸附材料的探針插入樣品上方氣相，一定時長的萃取過后，將探針拔出并直接插入GC進樣口脫附的技術。SPME在蜂蜜揮發性成分的研究中被廣泛應用。Karabagias等[12]對不同產地柑橘蜜的SPME分析中，萃取條件分別為探針涂層DVB/CAR/PDMS（Divinylbenzene/Carboxen/polydimethylsiloxane）、萃取溫度45 ℃、萃取時間30 min、平衡時間15 min、樣品量2 g和氯化鈉0.2 g。結果共檢測出33種化合物，其中總揮發物含量順序為摩洛哥＞希臘＞埃及＞西班牙。王桃紅等[13]運用SPME分析了60 ℃時14個成熟度不同（波美度35.6-42.0）的蕎麥蜜。結果共檢測出168種揮發性化合物，其中酯類和醇類在成熟度低的蕎麥蜜中含量較高，而醛類和酸類含量在成熟度高的蕎麥蜜中較高。此外，棗花蜜、刺槐蜜以及百花蜜等多種類蜂蜜的SPME分析也都有報道[14-16]。作為SPME的一種衍生技術，Cacho等[17]使用涂覆了吸附材料的攪拌棒對蜂蜜中的單萜類化合物進行分析。在PDMS、聚丙烯酸酯和乙二醇-硅酮三種涂層中，PDMS對芳樟醇、香葉醇、薄荷醇和桉樹油的靈敏度最高。此外，在12個蜂蜜樣品中，化合物的最高檢測濃度達到64 ng/g。

2 分析技術

2.1 色譜分析

氣相色譜質譜聯用儀（GC Mass spectrometry，GC-MS）是高效分析食品中揮發性化合物的儀器。在GC進樣口迅速氣化的化合物隨載氣（高純氦氣）進入色譜柱并被分離開，之后MS檢測器將其離子化并檢測定性。對于蜂蜜來說，已鑒定出的揮發性化合物在40種以上[18]。Pattamayutanon等[19]利用HS-SPMEGC-MS分析不同種類的泰國蜂蜜，結果共鑒定出63種揮發性化合物，其中有32種被認為是潛在的蜜源標記物。Karabagias等[20]利用HS-SPME-GC-MS分析了柑橘蜜、冷杉蜜、松樹蜜和百里香蜜四種蜜源共82個樣品，并進行了多元方差分析。結果表明，蒔蘿醚、α-4-二甲基-3-環己烯-1-乙醛、乙酸乙酯、辛酸乙酯、鄰氨基苯甲酸甲酯、2, 2, 4, 6, 6-五甲基庚烷、苯乙醛、順式芳樟醇氧化物和丁香醛（異構體Ⅲ）等9種化合物可以有效鑒定蜂蜜蜜源。王華堂等[21]還將指紋圖譜技術應用于中意蜂荔枝蜜的HS-SPME-GCMS分析，通過比對各荔枝蜜的色譜圖數據，找到并建立了包含有16個共有峰的荔枝蜜揮發性成分的指紋圖譜。此外，他們還針對中意蜂龍眼蜜分別建立了包含16個和15個共有峰的龍眼蜜揮發性成分的指紋圖譜[22]。其他一些運用HS-SPME結合GC-MS來研究蜂蜜中揮發性化合物的文獻匯總在表1中。在色譜分析中，化合物的有效分離是關鍵步驟，并且分離效果受到色譜柱種類的影響。蜂蜜中揮發性成分的分離通常采用非極性或弱極性的色譜柱（表1）。王桃紅等[13]分析蕎麥蜜時還對DB-5MS和VF-624的分離效果進行了比較。結果表明，無論是化合物峰個數還是響應值，DB-5MS均明顯優于VF-624。

表1 蜂蜜中揮發性化合物的HS-SPME-GC-MS分析條件及研究內容

全二維氣相色譜（GC×GC）是將兩臺配置了不同極性色譜柱的GC串聯，并且兩臺GC之間安裝有調制器，可以將第一根色譜柱分離后的化合物聚焦，接著傳入第二根色譜柱進行分離。所有被分離組分最后進入檢測器并最終得到以柱1保留時間為第一橫坐標（min），柱2保留時間為第二橫坐標（s），信號強度為縱坐標的三維色譜圖或二維輪廓圖，其中第二根色譜柱通常采用OV-1701、BPX50或各種環糊精作為固定相[40]。?pánik等[41]運用GC×GC-FID研究了蜂蜜中10種手性揮發性化合物的對映體比率，并得出結論：反式-芳樟醇氧化物的對映體比例可以用作向日葵和栗子蜂蜜的標記。該研究選用DB-FFAP作為第一根色譜柱，第二根色譜柱則根據化合物性質分別選用過甲基-β-環糊精（順（反）式-芳樟醇氧化物、（脫氫）芳樟醇和4（α）-松油醇）和6-叔丁基二甲基甲硅烷基-2, 3-二甲基-β-環糊精（丁香醛A-D）。區別于MS檢測器的離子分離原理（質荷比），離子遷移譜（Ion mobility spectroscopy，IMS）是根據離子的不同遷移時間來分離定性。HS-GC-IMS技術已被應用于蜂蜜摻假鑒定，其中色譜柱為FS-SE-54-CB-0.5或者HP-5MS UI[7,42]。火焰離子化檢測器（Flame ionization detector，FID）使用氮氣作為載氣，其通常與GC-MS結合使用并被用于蜂蜜揮發性成分研究中的條件優化部分[43]。

2.2 感官分析

感官分析可以對食品的氣味、滋味等感官屬性進行定性檢測和定量描述，其中描述性分析是食品感官分析領域中應用最廣泛的方法。Kru?ík等[44]在鑒別蜂蜜摻假的研究中發現了5個可能摻假的蜂蜜樣品。感官分析結果表明，這些樣品具有非自然或類似糖的氣味，雖然它們整體風味的評分還不錯，但是令人愉悅度卻比較低。感官分析還常與色譜分析結合使用來探索蜂蜜香氣與化合物之間的關聯性。Costa等[45]運用描述性分析和GC-MS對比了3種單花蜂蜜的風味特征。結果顯示，juazeiro蜂蜜具有強烈的焦糖香氣，且苯甲醛和苯乙醛可能與其特征性的風味有關系。Velame蜂蜜中酸類物質含量較高且具有丁香香氣。對于juremabranca蜂蜜，其草本香氣的重要貢獻化合物則可能是己醇、檸檬烯、α-法呢烯和δ-卡丁烯。Siegmund等[40]運用一種快速描述性分析方法（Napping）、GC-MS和GC×GC-MS對8種蜂蜜進行對比和分類，并進行了主成分分析。結果顯示揮發性化合物和感官評價的分析結果具有很高的關聯性，表明Napping非常適合對單種/單花蜂蜜進行快速分類。

隨著科技的進步，智能化的感官分析儀器不斷被研發出來并被用于食品分析。電子鼻是模擬人體嗅覺受體開發出來的分析揮發性氣味物質的儀器。它可以獲得蜂蜜中揮發性化合物的整體信息，常被用來進行蜂蜜種類的鑒別和分類[46]。嗅聞儀（Olfactometry，O）通過與色譜儀器的聯用，可以針對某一種揮發性成分進行氣味描述，并進一步確定影響蜂蜜香氣的關鍵性物質[47]。如敖常偉等[14]分析棗花和棗花蜜香味化合物的研究中，GC-MS-O的檢測結果顯示棗花的主要香氣來源為具有植物果香味的酯類物質，尤其是2-甲基丁酸乙酯。此外，17種共有成分是棗花蜜具有棗花香氣的主要原因。而在柑橘和黃芪蜂蜜中，苯乙醇是最有效的關鍵化合物并賦予蜂蜜花香氣味[2]。

3 結語與展望

蜂蜜的風味特征是反映蜂蜜品質的重要指標，而特征性風味的形成主要依賴于其中的揮發性化合物。因此蜂蜜中揮發性化合物的研究受到蜂蜜研究者及生產企業的關注。揮發性化合物的研究方法主要分為兩個部分：萃取分離和分析鑒定。頂空萃取有著溶劑萃取不可比擬的優勢，例如避免有機溶劑的使用和不需要過多的樣品處理。色譜分析和感官分析的結合使用，有利于獲取更全面的蜂蜜風味輪廓。總體來說，揮發性化合物的研究技術將不斷向著環保、快速、無損和高效的方向發展。目前，蜂蜜中揮發性成分的研究內容多為蜜源的鑒定和區分、蜂蜜摻假的檢測以及潛在標記物的鑒定等，而很少有蜂蜜成分的周期性變化分析。揮發性成分的組成不僅包括蜂蜜自身的香氣成分，還有生產儲藏過程中發生的理化或微生物反應的產物。因此，蜂蜜中的揮發性成分可能成為蜂蜜品質變化的潛在指標。