菌氨清的殺菌效果及對鯽魚的急性毒性研究

蔣文青 ，張可 ，葉更新 ，孫亞妮 ，魏蘭蘭 ，劉博 ，李澤 ，易誠 *

（1.南岳山區生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，衡陽師范學院生命科學與環境學院，湖南 衡陽 421008；2.南陽市質量技術監督檢驗測試中心，河南 南陽 473000）

含氯消毒劑占據了消毒劑市場較大份額，而傳統的氯制劑存在刺激大、不穩定、易殘留等問題[1]。二氧化氯（ClO2）作為目前國際上公認的A1 級消毒劑，具有安全、廣譜、高效、pH 值適用范圍廣等特點，其在低濃度（＜10 mg/L）下有殺菌、消毒作用[2-4]。二氧化氯通過抑制蛋白質的合成、引發氨基酸鏈斷裂、改變細胞膜的通透性、破壞ATP 酶、脂質過氧化等機制[5-11]高效殺滅細菌、真菌及各種孢子、病毒、藻類等微生物[2，11-13]。二氧化氯可有效去除錳、氰化物、硫化物、苯酚和有機物[11-12]，具有不產生“三致”作用、無殘留、安全和可持續消毒等優點，已成為氯系消毒劑的理想替代品[3，11]。目前已廣泛應用于畜牧養殖、造紙制漿漂白、食品保鮮、飲用水處理、醫療消毒、農業種植土壤消毒[14]、公共環境空間消毒[13]等領域[2-3]。

菌氨清是一種二氧化氯緩釋制劑，在水中能持續穩定釋放二氧化氯?，F通過設置不同的變量來評估菌氨清對大腸桿菌的殺滅效果和對鯽魚的急性毒性，為其在水產養殖領域使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌氨清主要成分為二氧化氯，由某公司制備提供，50 g/袋（生產批號：20190307）；Top 10 大腸桿菌，由衡陽師范學院畜禽養殖生物工程技術研究所保存；胰蛋白胨和酵母提取物購自Oxoid Ltd 公司；瓊脂粉購自Bio Froxx 公司；Na2HPO4等常規化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 菌氨清母液配制

將1 g 菌氨清溶于1 L 滅菌蒸餾水，有效成分質量濃度為100 mg/L，待黃色液體全部析出，混勻放置 10 min，即為母液，10 h 內用完。

1.3 菌氨清殺菌效果試驗

1.3.1 大腸桿菌的活化與濃度確定 將200 μL 大腸桿菌接種到裝有4 mL 液體培養基的試管中，37 ℃，160 r/min，培養 16～20 h。取 1 μL 活化后的菌液于EP 管中，按照倍比稀釋法，用滅菌PBS 緩沖液將其稀釋 103，106，109，1012倍，分別取 100 μL涂于LB 平板，37 ℃培養16 h，菌落計數，計算原菌液濃度。

1.3.2 菌氨清對大腸桿菌的殺滅效果 菌氨清試驗組分 3 個劑量組：10 mg/L 組、1 mg/L 組、0.1 mg/L組，設立滅菌PBS 緩沖液作對照組。每組取1 mL 溶液于滅菌 EP 管中，加入 10 μL 菌液（6×105CFU/mL），混勻，分別于5 ℃和25 ℃（每個溫度、每組設3 個重復）處理 1，10，20 min；12 000 r/min 離心 2 min 收集菌體，棄上清液，用100 μL 滅菌PBS 緩沖液混勻，涂于LB 平板，37 ℃培養16 h，菌落計數，計算殺菌效率。殺菌效率=（殺菌前大腸桿菌總數-殺菌后大腸桿菌總數）/殺菌前大腸桿菌總數×100%。

1.4 菌氨清對鯽魚的急性毒性試驗

1.4.1 試驗魚 試驗魚購自湖南省衡南縣潭子山鎮人工養殖場，選擇規格相近的健康鯽魚，體長7.9～9.2 cm，體質量 20～22.5 g，用經過充分曝氣、水溫為（13.0±1.5）℃的自來水暫養試驗魚一周，進行日常管理和投喂，每天換水。試驗前兩天不喂食，選擇規格整齊、身體健康的鯽魚隨機分組進行試驗。

1.4.2 試驗條件 試驗在64 cm×45 cm×38 cm 的水族箱中進行。試驗用水為曝氣3 d 除氯的自來水，水溫為（13.0±1.5）℃，pH 值為 8.68，溶解氧含量保持在6.0 mg/L 以上。

1.4.3 試驗方法 根據靜水式生物測試方法[15]，試驗期間每天更換藥液，不喂食、不充氧，更換藥液時，換充分曝氣的水。試驗期間測定水溫、pH 值、溶解氧和細菌總數變化。

根據《水生生物毒性試驗方法》[16]進行預試驗，設置 5 個質量濃度：1，10，20，40 和 80 mg/L，并設置對照組。每組10 尾魚，試驗進行48 h，多次重復，找出絕對致死濃度（LC100）和最大耐受濃度（LC0）。再確定正式試驗質量濃度分別為 1，2，4，6，8，10 和12 mg/L，并設置對照組。每組20 尾魚，重復3 次。試驗開始后前8 h 連續觀察，記錄試驗魚的行為和存活情況。若魚鰓蓋停止活動且5 min 內輕微刺激沒有反應，則判定魚死亡，撈出死魚，記錄死亡時間。記錄 24，48，72 和 96 h 的存活情況，采用直線內插法（straight-line intepolation），橫坐標為質量濃度對數，縱坐標為死亡率，計算半致死濃度（LC50）[16]；安全濃度=96 h LC50×0.1。測定放魚前與放魚24 h 后水體pH 值，放魚24 h 各組分別取 100 μL 水樣涂于LB 平板，37 ℃培養 16 h，菌落計數。

1.5 數據處理

利用SPSS 23.0 軟件對試驗數據進行統計分析，用平均數±標準差（Mean±SD）表示試驗數據。將試驗組與對照組的菌落數進行t 檢驗，以確定差異的極顯著水平（P＜0.01）；用單因素方差分析法中最小極差法（LSD）比較組間差異，以確定差異顯著水平（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 菌氨清對大腸桿菌的殺滅效果

經涂板、菌落計數可知，活化培養的大腸桿菌原液濃度為 6×109CFU/mL。溫度為 5 和 25 ℃、質量濃度為1 和10 mg/L 的菌氨清分別處理1，10，20 min后發現，無大腸桿菌生長，殺菌效率為100%；對5 ℃、0.1 mg/L 組處理 1，10，20 min 后，殺菌效率依次為97.5%，98.7%，98.9%；對 25 ℃、0.1 mg/L 組處理 1，10，20 min 后，殺菌效率依次為99.2%，99.4%，99.6%。經統計差異顯著性分析，菌氨清可極顯著殺滅大腸桿菌（P＜0.01）。溫度為 5 和 25 ℃、質量濃度為 0.1 mg/L 的實驗組，處理時間對大腸桿菌殺滅效果影響極顯著（P＜0.01）；0.1 mg/L 試驗組經過不同處理時間后，溫度對大腸桿菌殺滅效果影響極顯著（P＜0.01）；溫度為5 ℃的試驗組經過不同處理時間后，菌氨清質量濃度對大腸桿菌殺滅效果影響極顯著（P＜0.01）（表1）。

表1 菌氨清對大腸桿菌的殺滅效果①

2.2 菌氨清對鯽魚的急性毒性試驗

2.2.1 鯽魚對菌氨清的中毒反應 高濃度組（＞4 mg/L）中毒癥狀主要表現為魚體失去平衡、呼吸困難、鰓蓋及口部不時張大等，魚先上浮后沉底，體色變淡，3 h 后開始出現死亡，死亡魚體向一側彎曲。低濃度組（＜4 mg/L）中毒特征和高濃度組相同，出現癥狀時間較晚，長時間掙扎才會死亡。各濃度組死魚的體表和鰓部黏液多。

2.2.2 菌氨清對鯽魚的急性毒性作用 記錄24，48，72 和 96 h 的死亡數（表 2）。

由表2 可見，高濃度組（＞4 mg/L）試驗魚24 h內死亡過半。如1 mg/L 組，24 h 鯽魚的死亡率為0；2 mg/L 組，24 h 鯽魚的死亡率為15%，增幅為15%。而當菌氨清濃度從 2 mg/L 增為4 mg/L 時，24 h 鯽魚的死亡率為45%，增幅為30%，且死亡時間接近。最高濃度 12 mg/L 組，3 h 開始死魚，6 h 死亡率達到100%，且死亡的時間集中。

2.2.3 半致死濃度和安全濃度 用直線內插法處理表2 數據，得出菌氨清對鯽魚24，48，72 和96 h的LC50值并計算其安全濃度（表3）。

表2 菌氨清對鯽魚的急性毒性試驗結果

由表3 可見，菌氨清對鯽魚的半致死濃度為1.39～4.10 mg/L，安全濃度為 0.139 mg/L。

表3 菌氨清對鯽魚的急性毒性試驗數據的線性回歸分析

2.2.4 菌氨清在鯽魚急性毒性試驗中對pH 值和細菌總數的影響 放魚前，質量濃度為 0，1，2，4，6，8，10 和 12 mg/L 的試驗組水體 pH 值依次為 8.68，8.36，8.21，7.98，7.73，7.65，7.64，7.68；放魚 24 h 后，質量濃度為 0，1，2，4，6，8，10 和 12 mg/L 的試驗組水體 pH 值依次為 7.54，7.18，7.15，7.09，7.29，7.24，7.22，7.35（圖 1）。

由圖1 可見，試驗所用自來水中未檢出細菌，將試驗魚放入24 h 對照組與各濃度組的水中，細菌總數隨著菌氨清濃度的升高而降低。

圖1 菌氨清在鯽魚急性毒性試驗中對pH 值和細菌總數的影響

3 討論

隨著菌氨清質量濃度的增加，作用時間越長，殺菌效果越好。不同學者使用不同類型的含氯消毒劑對不同種類的細菌殺滅效果差異較大。張亞尼等[17]用300 mg/L 有效成分為次氯酸鈉的兩種消毒劑作用5 min，50 mg/L 有效成分為三氯異氰尿酸的消毒劑和150 mg/L 有效成分為二氯異氰尿酸鈉的消毒劑作用10 min，對大腸桿菌殺滅率分別為100%，99.99%和 99.999%；王妍彥等[4]用0.05 mg/L 二氧化氯消毒液對大腸桿菌作用24 h，平均殺菌效率為 98.94%；Ofori 等[10]用 5.0 mg/L 的二氧化氯能殺滅水中的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌；Ríos-Castillo 等[18]研究得出次氯酸鈉與其他化合物如氫氧化鈉等復配時才能有長期的抗菌效果。Orr 等[19]研究表明500 mg/L 的次氯酸鈉對蘋果表面的脂環酸芽孢桿菌殺滅率不高。本試驗結果顯示菌氨清對大腸桿菌的殺滅效果優于王妍彥等[4]的研究結果，且在較短時間，使用較少量便能有效殺滅大腸桿菌。

菌氨清對鯽魚的半致死濃度為1.39～4.10 mg/L，安全濃度為0.139 mg/L。根據化學藥物對魚類毒性等級評價標準[20]，菌氨清對鯽魚為有毒藥物。不同學者使用相同類型的消毒劑對不同種類的魚進行急性毒性試驗時，得到的結果差異較大。二氧化氯對鱖魚苗的半致死濃度為3.66～8.75 mg/L，安全濃度0.37 mg/L[15]，對黃顙魚的半致死濃度為32.481～48.497 mg/L，安全濃度為 3.2481 mg/L[21]，對攀鱸幼魚的半致死濃度為77.74～89.69 mg/L，安全濃度為24.691 mg/L[22]；本試驗結果與丁淑荃等[15]試驗結果相似，與其他學者的試驗結果差別較大，可能與消毒劑劑型的不同、消毒劑中有效成分含量的不同和魚的種類不同有關。1 mg/L 菌氨清對放養魚的水體殺菌效果不佳，但其對大腸桿菌殺滅效果好，可能是因為魚體攜帶的細菌數量過于龐大，低濃度的菌氨清無法將其全部殺死；10 mg/L 菌氨清對大腸桿菌和放養魚的水體殺菌效果好，但其在殺滅細菌時易造成鯽魚的死亡。因此，用菌氨清對鯽魚消毒時，建議質量濃度不應超過0.139 mg/L，使用菌氨清后保持一定的休藥期，避免其帶來負面影響。