圣路易斯腦炎病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

姚彥紅吳曉衛張偉

(1.甘肅醫學院病原生物學教研室，甘肅 平涼 744000；2.深圳市尚維高科有限公司分子生物學研究室，廣東 深圳 518000)

前言

圣路易斯腦炎病毒(St.Louis encephalitis virus，SLEV)隸屬于黃病毒科(family Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，病毒直徑大小為40～50nm，有表面突起的囊膜和濃集的核心，其基因組為單股正鏈RNA[1]。血清學分類與日本腦炎病毒、西尼羅熱病毒、墨累谷腦炎病毒等同屬乙型腦炎病毒群[2]。SLEV病毒于1933年首次發現于美國，主要流行于北美洲的密西西比河和俄亥俄河流域等區域，蟲媒是這種病毒的關鍵傳播載體，容易導致感染者患上頗為嚴重的中樞神經系統疾病，目前并無專門的疫苗與特效藥[3,4]。

圣路易斯腦炎病尚未在我國暴發流行，故國內對此病原檢測技術的研究目前很少，2017年張娜娜等[5]報道了一種基于制備含SLEV基因的假病毒顆粒的熒光定量PCR檢測方法用于檢測圣路易斯腦炎病毒，該方法的最低檢測限為1.8×103copies·mL-1。但是近些年，國際交流頻繁度不斷攀升，這意味著這種病毒有較大幾率傳入我國。為此，開發一種安全有效、簡便快捷的檢測方法對于該病毒的及時診斷和防控具有重要意義。

本文主要研究重組質粒技術結合熒光定量實時PCR檢測方法，這種方法憑借其靈敏度高、檢測快速、特異性高等優勢，在病原的基因表達水平分析、定量定性檢測等領域運用頗廣[6]。通過合成含有圣路易斯腦炎病毒的保守靶標基因和設計特異性引物和TaqMan探針，建立一種圣路易斯腦炎病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法，并對該方法進行驗證測試，探究其對于圣路易斯腦炎病毒的檢測效果，為相關部門或醫療機構對圣路易斯腦炎病毒的流行病學調查和傳染病監測提供一種技術基礎。

1 材料方法

1.1 病毒株、質粒

重組西尼羅病毒和黃熱病毒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司，登革熱病毒由江蘇國際旅行衛生保健中心惠贈，日本乙型腦炎病毒減毒活疫苗采購自成都生物制品研究所，圣路易斯腦炎病毒由本公司提供序列交于南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試劑和儀器

MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶、MMLV酶、熒光定量PCR通用試劑盒premix Taq購自寶生物工程(大連)有限公司。BL21感受態細胞、T4 DNA連接酶、限制性內切酶EcoR I/HindIII/NotI以及高保真酶PrimeSTAR均由NEB生產。pUC57載體及連接試劑盒由北京TIANGEN公司生產。上海華舜生物公司所提供的試驗用材分別為膠回收試劑盒、質粒提取、RNA提取試劑盒。本次使用的實時熒光定量PCR儀由美國應用生物系統公司生產，對應的系統是StepOne Software v2.0。

1.3 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.3.1 引物和探針設計

由NCBI數據庫中(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/)下載多條SLEV的基因序列進行反復比對分析，選取的圣路易斯腦炎病毒保守NS5基因核苷酸序列(GenBank登錄：KY271953.1)作為靶標，利用DNAStar系統開展同源性分析，由此篩選出特異核苷酸且高度保守的區域作為靶標區域合成氨芐抗性的質粒序列。在設計特異性熒光探針和引物過程中，使用的系統是Primer Express 5.0，而本次所選用的探針與引物均來自于南京金瑞斯生物公司，序列詳見表1。

表1 圣路易斯腦炎病毒NS5基因實時RT-PCR檢測的引物和探針

1.3.2 質粒鑒定與DNA核酸標準品制備

質粒合成后經測定，濃度為40ng·μL-1(原材料為干粉質粒4μg，加入100μL的TE溶液溶解)，拷貝數為2.99×1011copies·mL-1，測定方法參考徐珍等研究方法[7]。以10倍梯度稀釋濃度至2.99×102copies·mL-1，取少量各濃度下的質粒進行電泳鑒定，在100～250bp中間均有明顯的條帶。

制備SLEV病毒核酸標準品：-80℃下EP管中保存的BL21感受態細胞于冰上解凍，吸取濃度為40ng·μL-1的合成質粒5μL加入到95μL的BL21感受態細胞中，冰浴30min后,42℃熱休克90s再于冰上放置5min；加入900μL的LB培養基，37℃振蕩培養1h；離心后吸取100μL上清液涂布于LA平板上，37℃倒置培養過夜；挑取單菌落接種于LA液體培養基，37℃振蕩培養2h，取1.5mL的菌液根據酶切位點進行酶切，對酶切產物回收進行電泳，電泳跑出140bp條帶對應的菌液送上海生工測序鑒定。將測序正確的質粒克隆擴增作為SLEV病毒核酸標準品pUC57-NS5，使用質粒DNA快速小提試劑盒提取核酸并純化，-80℃保存備用。核酸標準品經過測定，濃度為6.61×109copies·mL-1。

1.3.3 樣本RNA提取

采用上海華舜生物技術有限公司的RNA提取試劑盒提取核酸，具體參考產品說明書。

1.3.4 Real-time PCR反應體系的建立及優化

在本次研究中，模板使用的是稀釋的重組質粒，獲取的指標主要是最高熒光增量值與最小Ct值，通過矩陣法分別對探針濃度(0.2～2μM)及探針濃度(0.1～1μM)加以優化，然后基于RT-PCR反應條件，選用最優的退火溫度來對濃度一致的重組質粒加以檢測，這個溫度區間在55～65℃。

1.3.5 標準曲線建立與結果判定

以質粒為對象，對其進行10倍梯度稀釋，使之為2.99×1010～29.9×100copies·mL-1，在最優反應環境下進行擴增，完成標準曲線的繪制。判定為陽性的條件為熒光強度增加值達到陰性對照3倍，同時循環閾值不超過40(含)，否則就可以將其判定為陰性。

1.3.6 特異性試驗

依次采用重組西尼羅病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒減毒活疫苗，以pUC57-NS5重組質粒為模板，完成RT-PCR擴增，由此對本試驗方法的特異性進行檢測。

1.3.7 敏感性試驗

以FBS將SLEV病毒核酸重組質粒標準品pUC57-NS5進行10倍梯度稀釋至6.61×101copies·mL-1，依次提取DNA與反轉錄cDNA，完成靈敏度檢測。

1.3.8 重復性試驗

以相同樣品為對象，基于一致性的條件，完成5次組間、組內試驗，完成本次試驗方法重復性檢測。

1.3.9 檢測方法的初步應用

從甘肅、新疆、內蒙等地牧場采集蚊蟲27份，從大連、天津、廈門、深圳等沿海港口城市郊區使用誘蚊燈捕捉蚊蟲49份，共計檢測蚊蟲樣品66份，將所有的蚊蟲研磨處理之后，取其中10份分別加入等量SLEV病毒核酸重組質粒(濃度為6.61×106copies·mL-1)，提取核酸圣路易斯腦炎病毒檢測。產物擴增結果送上海生工進行測序。

2 結果

2.1 質粒鑒定

質粒經過稀釋后進行凝膠電泳鑒定，凝膠電泳結果顯示，目的條帶約為140bp，與預期的長度大小一致，見圖1。

圖1 質粒電泳鑒定結果

2.2 反應體系的優化

優化探針、引物的退火溫度、濃度等參量，獲得最優RT-PCR反應體系：模板5μL，上/下游引物SLEV 3341Fp/SLEV 3480Rp (10pmol·μL-1)分別為1.5μL、TaqMan探針SLEV3380Probe(10pmol·μL-1)0.8μL、2×Premix Taq 12.5μL、MMLV酶(5U·μL-1)0.2μL、ddH2O 3.3μL、ROX Reference Dye(50×)0.2μL。具體反應條件：50℃15min，95℃ 5min，95℃ 15s，60℃30s、65℃ 30s，45個循環。60℃30s完成FAM熒光信號的采集。

2.3 標準曲線的繪制

以陽性重組質粒為對象，對其進行10倍稀釋，然后將其用作模板并進行擴增，由此便能獲得動力學曲線，其濃度為2.99×1010～29.9×100copies·mL-1，擴增效率與R2值分別為94.25%和0.9999，標準曲線方程為y=-3.4678x+44.682,具體可參見圖2。

圖2 熒光定量PCR標準曲線

2.4 特異性測試

依次選用SLEV病毒重組質粒pUC57-NS5、重組西尼羅病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒減毒活疫苗核酸用作模板，得到的擴增結果為陰性，沒有非特異性擴增情形，意味著此方法擁有頗佳的特異性。

圖3 熒光定量PCR特異性試驗

2.5 敏感性測試

將濃度為6.61×109copies·mL-1的SLEV病毒核酸重組質粒標準品pUC57-NS5進行10倍梯度稀釋至6.61×101copies·mL-1，將濃度6.61×108copies·mL-1、6.61×107copies·mL-1、6.61×106copies·mL-1、6.61×105copies·mL-1、6.61×104copies·mL-1、6.61×103copies·mL-1、6.61×102copies·mL-1、6.61×101copies·mL-1的稀釋樣品分別提取DNA并反轉錄cDNA，進行靈敏度檢測。結果顯示，最低可檢測到濃度為6.61×102copies·mL-1的SLEV病毒核酸重組質粒標準品。

圖4 熒光定量PCR檢測靈敏度試驗

2.6 重復性測試

通過重復性擴增試驗，能夠獲得Ct值變異系數不超過1.5%，這意味著RF-PCR檢測法具有較佳的可重復性，同時也有頗高的穩定性，詳細數據可參見表2。

表2 實時熒光定量PCR的組內、組間重復性試驗結果

2.7 檢測方法的初步應用

對采集的66份蚊蟲樣品經過檢測均為圣路易斯腦炎病毒陰性；加入SLEV病毒核酸重組質粒的5份蚊蟲樣品檢測結果為圣路易斯腦炎病毒陽性，擴散產物經過上海生工測序結果一致；單獨圣路易斯腦炎病毒陽性重組質粒為陽性。

圖5 檢測方法的應用檢測結果

3 討論

SLEV自1932年夏天在美國伊利諾伊州首次暴發流行，1933年夏天在密蘇里州的圣路易斯暴發流行病例達到1000人，據已有文獻報道，圣路易斯腦炎僅在北美地區流行[8]。人類是目前已知的自然感染該圣路易斯病毒后致病的唯一宿主，感染后可使人類中樞神經系統感染性疾病，嚴重者甚至死亡，且高齡是病死的高危因素，成人感染病死率10%～25%[9,10]。目前并無圣路易斯病毒感染針對性治療藥物，結合當前世界人民全球性流動可能導致圣路易斯腦炎在國內傳播流行，所以，想要更好地做好疫情篩查與控制工作，就必須要創建早起快速診斷體系。圣路易斯腦炎病毒作為可感染人類且致病的病原，運用熒光定量PCR檢測方法進行檢測具有實現快速檢測的特點，本次成功完成RF-PCR檢測法的設計與優化，為這種病毒的監測與檢測提供了更為快速、特異與靈敏的方法。使用本方法對采集的66份蚊蟲樣品和5份加入SLEV病毒核酸重組質粒的蚊蟲樣本進行檢測，在66份蚊蟲樣本中未檢測出圣路易斯腦炎病毒的陽性，混合有SLEV病毒核酸樣品中檢測出圣路易斯腦炎病毒的陽性結果，說明本研究方法在臨床樣品檢測上結果準確，陽性檢出率為100%。

本研究運用生物學軟件反復對比分析圣路易斯腦炎病毒的基因序列，在確定以其保守片段NS5基因作為靶標后，設計引物和熒光探針，使用合成重組質粒樣品，按照正交試驗方法對反應體系進行了優化，成功開發了SLEV病毒的RF-PCR檢測技術。通過本次所提供的檢測方法對圣路易斯腦炎病毒質粒標準品進行敏感性檢測，結果顯示，最低可檢測到濃度為6.61×102copies·mL-1。特異性試驗表明，建立的方法對于黃病毒屬的其它病原不存在非特異性擴增情況，完全可以針對圣路易斯腦炎病毒的鑒別檢測。重復性測試表明，該方法檢測的變異系數小于1.5%，檢測方法穩定性良好。

綜上所述，本研究建立的圣路易斯腦炎病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法能夠運用于對圣路易斯腦炎病毒的檢測，該方法可以為圣路易斯腦炎病毒的流行病學調查和傳染病監測提供一種技術基礎，便于醫院、疾控和相關檢測機構更好地應對疾病和疫情的診斷和監測。