基于ISSR分子標(biāo)記的湖北野生夏枯草遺傳資源分析

董元火白雪依廖新安夏恒建張文才王圣軍彭仕梅郭雙喜

(1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056；2.湖北省蘄春縣科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)信息局，湖北 蘄春 435399；3.李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，湖北 蘄春 435399；4.蘄春縣中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，湖北 蘄春 435399)

2021年7月9日，習(xí)近平總書(shū)記主持召開(kāi)中央全面深化改革委員會(huì)第二十次會(huì)議，審議通過(guò)了《種業(yè)振興行動(dòng)方案》。會(huì)議強(qiáng)調(diào)必須推進(jìn)種業(yè)振興，必須把民族種業(yè)搞上去，把種源安全提升到關(guān)系國(guó)家安全的戰(zhàn)略高度，實(shí)現(xiàn)種業(yè)科技自立自強(qiáng)、種源自主可控。

種質(zhì)資源，又稱遺傳資源或基因資源，是培育作物和中藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是維系國(guó)家食物和藥品安全的重要保證[1]。中醫(yī)藥作為我國(guó)獨(dú)特的衛(wèi)生資源，在經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展和促進(jìn)人類健康中發(fā)揮著重要作用。種質(zhì)資源是中藥材生產(chǎn)的源頭，種質(zhì)的優(yōu)劣對(duì)中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量有決定性作用[1]。種質(zhì)資源的遺傳多樣性是其影響中藥材質(zhì)量的根本內(nèi)在機(jī)理，研究保存物種的遺傳多樣性對(duì)其種質(zhì)資源的保護(hù)與利用以及育種有重要意義[2]。保護(hù)遺傳多樣性是生物多樣性保護(hù)工作中最根本的任務(wù)，也是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)利用發(fā)展戰(zhàn)略的基本保障。

夏枯草(Prunella vulgaris L.)隸屬唇形科夏枯草屬，因“夏至后即枯”得名，是常見(jiàn)傳統(tǒng)中藥之一。干燥果穗是主要的藥用部位，干燥果穗入藥稱“夏枯球”，全草入藥稱“夏枯草”。有清熱明目、瀉肝火、清熱散結(jié)、降壓、降糖、抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒及增強(qiáng)免疫力等功效[3]。2011年已被湖北省科技廳列為全省優(yōu)先發(fā)展的3大主要優(yōu)勢(shì)品種之一[4]。蘄春夏枯草，為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，是蘄春精準(zhǔn)脫貧的重要產(chǎn)業(yè)。

目前，夏枯草的研究主要涉及藥材鑒別、化學(xué)成分、藥理作用、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、生態(tài)學(xué)和種植等方面[4,5-10]，而夏枯草野生遺傳資源的狀況和評(píng)價(jià)研究報(bào)道相對(duì)較少，董元火等[11]基于迷迭香酸的含量評(píng)價(jià)了湖北夏枯草野生種質(zhì)資源。中藥材野生品與栽培品的研究表明，野生與栽培藥材既存在差異又體現(xiàn)共性；野生品與栽培品既有質(zhì)量差異大的品種，如丹參、天麻、魚(yú)腥草等[12-14]，又有質(zhì)量等同的品種，如防風(fēng)、黃芩等[15,16]，這與種質(zhì)資源密不可分。種質(zhì)資源是藥材生產(chǎn)的源頭，種質(zhì)的優(yōu)劣對(duì)產(chǎn)量和質(zhì)量具有決定性的影響。本研究擬基于ISSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性評(píng)價(jià)野生夏枯草種質(zhì)資源，為夏枯草種質(zhì)資源保護(hù)和品種改良、中藥材品質(zhì)的提高奠定基礎(chǔ)，助力夏枯草產(chǎn)業(yè)在鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的材料分別采自湖北的武漢、蘄春、襄陽(yáng)和崇陽(yáng)4個(gè)地方。根據(jù)研究所需，保證取樣間距5m以上，隨機(jī)采取夏枯草幼嫩葉片并用硅膠保存。提取夏枯草干燥葉片中的DNA，保存于-20℃冰箱中。由于襄陽(yáng)和崇陽(yáng)種群相對(duì)較小，因此該兩種群所取樣本較少。具體樣品數(shù)及相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 基于ISSR分析的4個(gè)野生夏枯草種群的樣品信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 夏枯草基因組DNA的提取及檢測(cè)

采用改進(jìn)的CTAB法[17]提取夏枯草葉片中的基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀(Eppendorf BioPhotometer plus，Eppendorf AG，Hamburg，Germany)分別測(cè)定其純度和濃度，選取260/280處OD值在1.8～1.9的DNA樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增及分析。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增

從4個(gè)夏枯草種群中分別取1個(gè)DNA樣品，共選取4個(gè)DNA樣品進(jìn)行引物篩選，所用ISSR引物是加拿大哥倫比亞大學(xué)公布設(shè)計(jì)的序列，具體見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增后，對(duì)比可重復(fù)性、多態(tài)性及清晰度后，篩選確定擴(kuò)增效果良好的引物。采用的PCR擴(kuò)增儀為PTC-100TMthermocycler(MJ Research，Inc)。PCR反應(yīng)體系參考廖麗等[18]研究方法，并作適當(dāng)改進(jìn)。

ISSR-PCR反應(yīng)體系(25μL)：含有13μL雙蒸水，2.5μL(2.5mmol·L-1)dNTP，2.5μL 10×PCR Buffer(含10mmol·L-1Tris-HCl，1.5mmol·L-1MgCl2和50mmol·L-1KCl)，1.0μL(25mmol·L-1)MgCl2，0.5μL Taq Polymerase，1.5μL引物(25pmol)，4μL模版DNA。

PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；接35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94℃變性30s，53℃復(fù)性(退火)45s，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸7min。

DNA樣品PCR擴(kuò)增完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將ISSR-PCR產(chǎn)物電泳所有的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同一位點(diǎn)條帶有標(biāo)記為1，無(wú)標(biāo)記為0。采用POPGENE32軟件[19]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，主要統(tǒng)計(jì)參數(shù)包括多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、Nei′s基因多樣性(Ht)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、遺傳一致性和遺傳距離。采用MEGA7.0.26軟件，基于Nei′s的遺傳距離，構(gòu)建4個(gè)種群的UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR有效引物

從50個(gè)引物中，根據(jù)可重復(fù)性、多態(tài)性及清晰度，篩選確定擴(kuò)增效果良好的9個(gè)引物，具體見(jiàn)表2。

表2 ISSR引物序列以及每條引物擴(kuò)增帶的情況

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用篩選出的引物對(duì)夏枯草所有21個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)顯示，其檢測(cè)部分結(jié)果如圖1所示。

圖1 引物809對(duì)部分DNA樣品擴(kuò)增的ISSR電泳圖

2.3 遺傳多樣性

根據(jù)凝膠電泳圖譜條帶，采用POPGENE32分析顯示，武漢種群內(nèi)(WHX)和蘄春種群(QCX)多態(tài)性位點(diǎn)(PPB)分別為78.95%和75.44%，2個(gè)種群的遺傳多樣性比較高，而崇陽(yáng)種群(CYX)遺傳多樣性最低，多態(tài)性位點(diǎn)為43.86%，具體見(jiàn)表3。4個(gè)種群總共的多態(tài)性位點(diǎn)為98.25%，物種水平Nei′s基因多樣性(Ht)和Shannon′s信息指數(shù)(I)分別為0.37和0.54。QCX和WHX種群間的遺傳一致性最大(0.8972)，與2個(gè)種群間遺傳距離最小的結(jié)果相吻合。CYX與QCX種群間的遺傳一致性最小(0.7323)，與之相適應(yīng)的二者間的遺傳距離性最大(0.3115)，其結(jié)果也相互應(yīng)證。基于Nei′s的遺傳距離UPGMA聚類圖顯示崇陽(yáng)種群(CYX)單獨(dú)分為一支，具體見(jiàn)圖2。

表3 基于ISSR標(biāo)記分析的4個(gè)夏枯草種群遺傳多樣性水平

表4 4個(gè)種群的Nei氏遺傳一致性和遺傳距離

圖2 基于Nei′s遺傳距離的4個(gè)野生夏枯草種群的

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源遺傳多樣性是利用基因資源的基礎(chǔ)和引種、栽培及資源保護(hù)的基礎(chǔ)。從資源保護(hù)和利用的角度，必須要盡量多地保留遺傳多樣性[20]。在本研究中，ISSR分析顯示武漢種群內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)有78.95%，蘄春種群內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)有75.44%，襄陽(yáng)種群內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)有52.63%，崇陽(yáng)種群內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)為43.86%，表明武漢和蘄春的野生夏枯草的遺傳多樣性較高。因此，要更好地保護(hù)其高的遺傳多樣性種群，同時(shí)，在開(kāi)展夏枯草“野轉(zhuǎn)家”種植時(shí)應(yīng)該優(yōu)選考慮蘄春和武漢各種群夏枯草種植及技術(shù)研究，有效解決因長(zhǎng)期人工大規(guī)模種植導(dǎo)致的產(chǎn)量和品質(zhì)下降的問(wèn)題。4個(gè)種群總共的多態(tài)性位點(diǎn)有98.25%，物種水平Nei′s基因多樣性(Ht)和Shannon′s信息指數(shù)(I)分別為0.37和0.54，表明夏枯草在物種水平存在高水平的遺傳多樣性，具體見(jiàn)表3。與沈宇峰等[21]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)研究的夏枯草種質(zhì)資源遺傳多樣性中揭示的多態(tài)位點(diǎn)百分率93.91%結(jié)果相似，這說(shuō)明基于ISSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析結(jié)果相對(duì)比較可靠，該技術(shù)可以有效運(yùn)用在大多數(shù)植物的遺傳多樣性分析中。物種適應(yīng)環(huán)境和保持進(jìn)化潛力的物質(zhì)基礎(chǔ)是遺傳變異，一個(gè)物種的分布廣泛與否、種質(zhì)資源豐富與否都與該物種自身的遺傳多樣性有關(guān)。本研究顯示，武漢種群和蘄春的夏枯草的多態(tài)位點(diǎn)百分率高，表明遺傳多樣性較高，遺傳資源豐富，而崇陽(yáng)夏枯草多態(tài)位點(diǎn)百分率最低，為43.86%，遺傳多樣性最低，遺傳資源相對(duì)不豐富，與崇陽(yáng)夏枯草種群較小(種群面積20～30m2)有關(guān)。因此，要通過(guò)種群更新、恢復(fù)、擴(kuò)繁及野生種質(zhì)資源交流，提高其遺傳多樣性。