ASA處理對蘋果果實抗壞血酸
——谷胱甘肽循環和膜脂過氧化水平的影響

鄧惠文，王應強，韓 雍，孟建剛

(1.隴東學院 農林科技學院，甘肅 慶陽 745000；2.天池鄉農業服務中心，甘肅 環縣 745700)

蘋果是我國大宗類水果之一主要以鮮食為主[1-2]。富士蘋果以其營養豐富，色澤鮮艷、香氣怡人、肉質甜脆而深受消費者的喜愛[3-4]。霉心病、青霉病、灰霉病和炭疽病是蘋果貯藏期的主要病害，粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)是引起霉心病造成果實爛損的主要的病害之一[5]。霉心病主要發生在果實貯藏期，包括干腐和濕腐，其發病癥狀表現為果肉呈現水漬狀、褐色、味苦[6]。目前主要采用化學殺菌劑控制，但長期使用化學殺菌劑對人體健康、環境存在危害并且會產生病原物抗藥性增加[7-8]等問題。

乙酰水楊酸(Acetyl Salicylic Acid,ASA)在植物體內轉換為SA，作為小分子信號物質在誘導植物抗病性方面有著明顯的效果[9-11]。研究顯示：采前ASA噴灑處理通過促進苯丙烷代謝和抗氧化酶活性誘導活性氧代謝，能夠有效誘導采后哈密瓜果實的抗病性[12]。此外，甜瓜抗病性研究中發現誘導抗病與果實膜脂過氧化及丙二醛的積累密切相關[13]。然而，關于ASA對蘋果抗壞血酸-谷胱甘肽循環和膜脂過氧化水平的影響尚未見報道。本文以隴東地區“富士”蘋果為材料，探究采后ASA處理對損傷接種T.roseum蘋果果實果肉及果心病斑直徑的影響，旨在探討ASA處理對抗壞血酸-谷胱甘肽循環及果實膜脂過氧化的影響，以期為蘋果霉心病的防治提供基礎理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以“紅富士”蘋果為材料，采自甘肅省慶陽市西峰區溫泉鄉，于2018年9月底采摘無機械損傷和病蟲害、大小均一的果實。

供試粉Troseum分離于自然發病的富士蘋果，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)上保存待用。

本試驗用的ASA分析純，三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)、亞油酸、NaOH、HCL、硼酸等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GY-Ⅰ型水果硬度計，杭州托普儀器有限公司；WYT-Ⅱ型阿貝折光儀，鄭州南北儀器設備有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；Thermo8600超低溫冰箱，杭州明凱科技有限公司；TGL-16低溫離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

2mmol/L ASA浸泡處理，以自來水為對照(CK)，在溫度20±2℃、RH60±5%條件下貯藏10d。貯藏期間每隔2d取樣一次測定相關指標。

1.4 測定指標與方法

果心病斑直徑：參照Serdani M的方法[14]。無菌條件下，將表面消毒后的蘋果縱切，每個蘋果用牙簽在心皮刺孔2次，接種1×105個/mLT.roseum孢子懸浮液10μL；無菌水為對照，保鮮膜密封后，在無光照25℃條件下培養，十字交叉法測定病斑直徑。果肉病斑直徑：參照葛永紅的方法[15]。

丙二醛(MDA)含量：參照Hodges等的方法[16]，3.0g果肉組織中加入5mL100g/L三氯乙酸(TCA)提取液研磨成勻漿，4℃12,000×g條件下離心20min。取2mL上清液，加入2mL0.67%的2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混合后煮沸20min，對照空白管中加入2mL100g/L TCA溶液代替提取液。分別測定反應液在450nm、532nm和600nm處的吸光度值，MDA含量用(nmol/g FW)表示。

脂氧合酶(LOX)活性：參照劉歡等的方法[13]。

AsA和DHA含量的測定：分別參照Tanaka的方法[17]和Arakawa的方法[18]，取果肉組織3.0g加5mL預冷的100mmol/L鹽酸提取液冰浴研磨，然后在4℃、7800r/min條件下離心10min，上清液立即用于AsA和DHA的測定。AsA的測定：取100μL上清液加入2mL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)再加入0.5mL蒸餾水在265nm下測定其吸光度值。總ASA的測定：取100μL上清液加入2mL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)再加入0.5mL 2mmol/L DTT置于室溫下(25℃)反應8min使DHA全部還原為AsA，之后在265nm下測定其吸光度值。則DHA含量=總AsA含量-AsA含量。結果以μg·gFw-1表示。

GSH和GSSG含量的測定：參照Griffith[19]的方法。取3g果肉組織，加入5mL冰冷的6%的偏磷酸(pH2.8)，冰浴研磨，勻漿液于4℃、12500r/min離心20min，取上清液來立即測定GSH和GSSG的含量或儲存在-20℃下等待測定。總的GSH和GSSG含量測定：500μL提取液加2.5mL反應液包含800μL反應液1(110mmol·L-1Na2HPO4·7H20，40mmol·L-1NaH2PO4·H2O，15mmol·L-1EDTA，0.3mmol·L-1DTNB，0.04%BSA)、800μL反應液2(1mmol·L-1EDTA，50mmol·L-1咪唑和0.02%BSA)、800μL反應液3(5%Na2HPO4，pH7.5的溶液稀釋50倍)和100μL 9.0mmol·L-1NADPH。以6%的偏磷酸(pH2.8)代替提取液作為對照，蒸餾水作參比，在412nm下測其吸光值，則OD總GSH+GSSG=OD樣品-OD對照。GSSG含量測定：500μL提取液加入2.5mL乙烯吡啶(稀釋50倍)在25℃下水浴1h，以6%的偏磷酸(pH2.8)代替提取液作為對照，蒸餾水作參比，在412nm下測其吸光值，則ODGSSG=OD樣品-OD對照。GSH的=總的GSH和GSSG含量-GSSG。

GR活性的測定：參照Foyer和Halliwell[20]的方法。APX和DHAR活性的測定：參照Nakano和Asada[21]的方法。MDHAR活性的測定：參照Hossain等[22]的方法。試驗中各測定指標均重復測定3次。

1.5 數據分析

數據采用SPSS 17.0數據分析軟件和EXCEL軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 ASA處理對損傷接種T.roseum果肉和果心組織病斑直徑的影響

由圖1A可知，對照和ASA處理在貯藏6-15d病斑直徑均呈現上升趨勢。ASA處理的果實在整個貯藏期間病斑直徑均顯著(P<0.05)低于對照組果實。ASA處理可以抑制由T.roseum侵染引起霉心病在果肉組織病斑的擴展。

由圖1B可知，對照和ASA處理果實的果心在貯藏4-7d病斑直徑均呈現上升趨勢。在整個貯藏期間，ASA處理果實的果心病斑直徑顯著(P<0.05)低于對照組果實果心。ASA處理可以降低由T.roseum侵染引起霉心病在果心病斑直徑。

圖1 ASA處理對損傷接種T.roseum果肉病斑直徑(A)和果心組織病斑直徑(B)的影響

2.2 ASA處理對果實丙二醛(MDA)含量的影響

由圖2可知，對照組果實在貯藏0-8d MDA含量迅速上升。ASA處理的果實MDA含量上升較為緩慢。經過ASA處理的果實在整個貯藏期間MDA含量顯著(P<0.05)低于對照組果實。ASA處理通過延緩丙二醛含量的上升，抑制膜脂過氧化程度。

圖2 ASA處理對蘋果果實丙二醛(MDA)含量的影響

2.3 ASA處理對果實脂氧合酶(LOX)活性的影響

由圖3可知，對照組果實在貯藏0-6d LOX活性快速上升，隨后下降。ASA處理的果實0-6d LOX活性相對緩慢，6-8d下降。ASA處理的果實在同一貯藏時間LOX酶活顯著(P<0.05)低于對照組果實。ASA處理通過降低蘋果果實LOX活性，抑制膜脂過氧化。

圖3 ASA處理對脂氧合酶(LOX)活性的影響

2.4 ASA處理對果實非酶抗氧化物質含量的影響

由圖4A可知，貯藏期間ASA處理組果實AsA含量均顯著(P<0.05)高于對照組果實。AsA含量對照組果實在貯藏0-6d上升速度較快，6-8d呈現緩慢下降的趨勢。ASA處理組果實0-2d上升迅速，隨后2-6d緩慢上升，最后下降。由圖4B可知，對照組和ASA處理組蘋果果實貯藏期間DHA含量均呈現上升趨勢，并且ASA處理組果實DHA含量均顯著(P<0.05)低于對照組果實。由圖4C可知，貯藏期間ASA處理組果實GSH含量均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實GSH含量在貯藏0-6d上升迅速，之后緩慢下降。由圖4D可知，貯藏期間ASA處理組果實GSSG含量均顯著(P<0.05)低于對照組果實。0-8d對照組果實和處理組果實GSSG含量均呈現下降趨勢，但相對于對照組果實ASA處理下降較為緩慢。上述結果表明，ASA處理可有效地提高蘋果果實AsA和GSH含量，降低果實中DHA和GSSG含量。AsA和GSH作為抗氧化物質能夠直接清除果實中積累的活性氧，從而抵御外界傷害。

圖4 ASA處理對蘋果果實抗壞血酸含量(A)、脫氫抗壞血酸(B)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的影響

2.5 ASA處理對果實抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響

由圖5A可知，在貯藏期間ASA處理組果實APX活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實APX酶活在貯藏0-6d呈上升趨勢，隨后下降；由圖5B可知，貯藏期間ASA處理組果實GR活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實APX酶活在貯藏0-8d整體呈現較緩慢的上升趨勢。ASA處理組果實0-2d上升速度較快，2-6d逐漸上升，之后下降。上述結果表明，ASA處理可提高蘋果果實APX和GR活性。APX和GR作為AsA-GSH循環中重要抗氧化酶，通過提高APX和GR活性，提高果實的抗氧能力，使ASA-GSH循環維持平衡。

圖5 ASA處理對蘋果果實抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響

2.6 ASA處理對果實脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性的影響

由圖6A可知，貯藏期間ASA處理組果實DHAR活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和處理組果實DHAR活性在貯藏0-6d呈上升趨勢，6-8d逐漸下降。由圖6B知，貯藏期間ASA處理組果實MDHAR活性均顯著(P<0.05)高于對照組果實。對照組果實和MDHAR活性在貯藏0-4d逐漸上升，4-8d緩慢下降。ASA處理組果實0-2d迅速上升，隨后下降。上述結果表明，ASA處理可使DHAR和MDHAR活性維持在一個較高的水平。DHAR和MDHAR是促進AsA-GSH循環有效運轉的酶，使得活性氧能夠及時被清除。

圖6 ASA處理對蘋果果實脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性的影響

3 討論

先前試驗顯示[23]ASA能夠誘導果實的抗病性，降低果實采后病斑直徑，從而顯著降低采后爛損。本研究顯示ASA處理通過促進抗壞血酸-谷胱甘肽循環，抑制膜脂過氧化程度增加果實抗病性，從而有效抑制損傷接種T.Roseum蘋果果實果肉及果心組織病斑直徑的擴展。

馬玄等[24]在杏子果實，以及前期試驗結果[23]顯示ASA采后誘導抗病性與活性氧代謝密切相關。外界生物或誘抗劑脅迫下，活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)瞬間大量積累使細胞膜損傷，植物體內存在一套完整的抗氧化體系能夠迅速將ROS的水平降低到正常水平，其中抗壞血酸谷胱甘肽循環(AsA-GSH)是主要的清除系統。AsA-GSH循環主要由4種抗氧化酶和4種非酶抗氧化物質組成。試驗結果表明，ASA處理能夠提高抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性，增加抗壞血酸(AsA)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量，而一定程度上降低脫氫抗壞血酸(DHA)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量。由于ASA處理組果實較對照組果實能夠維持較高的APX、GR、DHAR、MDHAR活性，從而促進AsA-GSH循環高效運轉，增加果實活性氧的清除能力；AsA、GSH含量增加，DHA和GSSG含量將低,增大AsA/DHA和GSH/GSSG比值，從而使AsA-GSH循環中抗氧化物質維持在較高的還原態，能夠有效猝滅瞬間氧爆產生的ROS。

ROS代謝和細胞膜質過氧化息息相關。果實體內ROS大量積累會導致膜脂過氧化，從而破壞細胞膜的結構的完整性和功能[25]。LOX是植物脂肪酸氧化途徑中的關鍵酶，LOX不僅對質膜產生破壞，并且催化產生的過氧化物等還對有機體的活性物質造成損傷[26]。MDA積累是反映植物組織膜脂過氧化程度的重要指標[26,27]。試驗結果顯示，ASA處理果實能夠抑制MDA含量升高，降低LOX酶活性，從而減緩果實膜脂過氧化程度，保持細胞膜結構完整性，增加耐貯性。

4 結論

ASA處理有效控制由T.Roseum引起的蘋果霉心病；提高果實中AsA和GSH含量，降低DHA、GSSG的含量，增加APX、GR、DHAR和MDAR酶的活性，增強果實的ROS清除能力；降低果實MDA含量和LOX酶活性，減少過量ROS對細胞膜的造成的傷害。