雌激素及其受體ERβ在氰戊菊酯所致雄性大鼠生殖毒性中的作用

郭 茂，陳 琰，李興元，孔德營

遵義醫科大學 基礎醫學院生理學教研室，貴州 遵義 563000

氰戊菊酯(Fenvalerate，Fen)是一種Ⅱ型擬除蟲菊酯類農藥，因其具有高效、 低毒、 低殘留等特點，而被廣泛應用于農業生產和家庭生活中，但其對人類的生殖健康具有明顯的危害性．研究表明，氰戊菊酯是一種環境內分泌干擾物[1]，具有明顯的雄性生殖毒性，可通過影響睪酮合成相關酶和蛋白的表達而影響雄性體內睪酮的含量，以及影響支持細胞和間質細胞的功能來干擾下丘腦-垂體-性腺軸的調節作用[2-5]，使雄性生精過程受損，導致精子數量減少及活力降低．此外，研究表明，雄性體內的雌激素對雄性生殖功能也具有重要調節作用[6]，氰戊菊酯在干擾睪酮分泌的同時，是否也干擾了雄性體內的雌激素分泌以及其受體的表達從而產生生殖毒性？為了驗證我們的猜想，本研究擬通過分析雌激素及其受體ERβ在Fen染毒后的表達情況，探討Fen等擬除蟲菊酯類農藥殺蟲劑所致雄性生殖毒性的相關機制.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑

Fen原藥(純度98.80%)，北京壇墨質檢科技有限公司產品； HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司； 雌二醇(E2) ELISA試劑盒，上海江萊生物科技有限公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司； CYP19A1，Caspase 3，Caspase 9抗體，英國Abcam公司； ERβ，Bax，Bcl-2抗體，武漢三鷹生物技術有限公司； RNA逆轉試劑盒和SYBR Premix Ex Taq，日本Takara 公司； TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(增強型綠光)，武漢伊萊瑞特生物科技公司.

1.1.2 儀 器

低溫高速離心機，美國Thermo公司； 分光光度計(ND2000C型)，美國Thermo公司； 酶標儀，美國Bio-Rad公司； 顯影儀，美國Syngene公司； PCR儀，美國Life Technogies公司； 熒光顯微鏡，日本Olympus公司.

1.2 方 法

1.2.1 實驗動物與處理

體質量220～250 g健康性成熟的雄性SD大鼠24只，購自重慶騰鑫生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001．大鼠適應性喂養1周后采用隨機數表法將大鼠分為對照組(Fen 0 mg/kg)、 低劑量Fen染毒組(20 mg/kg)、 高劑量Fen染毒組(40 mg/kg)，每組8只．染毒組以玉米油溶解配制成不同濃度的Fen溶液等體積灌胃，灌胃量為每100 g體質量0.5 mL，每日1次，灌胃前后大鼠自由攝食、 飲水，連續染毒30 d(大鼠的一個生精上皮周期為12～15 d)，對照組給予等量玉米油．大鼠按12 h白晝的節律調節光照，保持適宜溫度(22±2 ℃)和相對濕度(60%±5%)．連續染毒30 d后，將大鼠稱質量后麻醉，心臟采集血樣，然后迅速分離雙側附睪和睪丸．采集的血液待其凝固后離心(常溫，1 100 r/min，20 min)，吸取上清液分裝后于-80 ℃保存，用于檢測血清雌激素水平； 分離的附睪和睪丸迅速稱其質量，然后用生理鹽水沖洗表面的血污，附睪立即用于精子計數及活力檢測，右側睪丸經液氮速凍，-80 ℃凍存，用于測定睪丸雌激素水平，檢測CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9 mRNA和蛋白的表達情況，左側睪丸用4%甲醛固定后用于病理結構觀察和生殖細胞凋亡檢測.

1.2.2 精子計數、 活力及畸形檢測

參照Kong等[7]的方法并稍作調整檢測雄鼠附睪精子數量及活力情況．取單側附睪尾制備精子懸液，將懸液放入含0.1%牛血清白蛋白的Ham ’s F-12培養基中，放入37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中孵育20 min，光學顯微鏡下(400×)計數400個精子中各級活力(a級：快速直線運動； b級：慢速直線運動； c級：原地打轉或運動遲緩； d級：無活動)的精子數，計算各級精子活力和活動率．于60 ℃水浴中處死精子，用血細胞計數法計數每克附睪中的精子總數．吸取10 μL精子懸液于載玻片上涂片，涼干，甲醇固定30 min，伊紅染液染色10 min，自來水沖洗玻片，涼干后鏡檢，每個樣本計數1 000個精子，統計正常與畸形精子數，計算精子畸形率.

1.2.3 睪丸組織病理形態學檢查

取固定于4%甲醛的睪丸組織，經梯度乙醇脫水、 浸蠟、 石蠟包埋、 切片(厚4 μm)，每只動物隨機選擇4張切片，經HE染色，中性樹膠封片，然后于光鏡下觀察其形態學變化，如曲細精管的完整性、 生殖細胞的數量等.

1.2.4 血清及睪丸雌二醇(E2)檢測

睪丸組織勻漿制備：用預冷的磷酸鹽緩沖液PBS(0.01 mol/L，pH值為7.4)沖洗睪丸組織，去除殘留血液，稱質量后將組織剪碎．將剪碎的組織按每克的組織樣品加入5 mL的PBS，于冰上充分研磨．最后將勻漿液離心(4 ℃，1 100 r/min，10 min)，取上清分裝后于-80 ℃保存用于檢測．操作步驟嚴格按照E2 ELISA試劑盒說明書進行，取E2標準品、 血清或睪丸組織勻漿加入反應孔，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體，37 ℃恒溫箱溫育60 min，洗板，加入反應底物，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，加入終止液，測定吸光度(OD值)，繪制標準曲線計算濃度.

1.2.5 Real-time PCR法檢測大鼠睪丸CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達情況

取-80 ℃凍存的睪丸組織100 mg研磨成粉末狀，然后采用RNAiso-Plus提取試劑提取樣本總RNA，按產品說明書進行實驗．采用分光光度計測定總的RNA濃度，根據光度計260 nm和280 nm處的吸光度比值測定其純度．按照RNA反轉錄試劑盒要求，將所有樣本總RNA濃度調整為100 ng/μL，取10 μL進行逆轉錄，反應條件：37 ℃ 15 min； 85 ℃ 5 s； 4 ℃保存．按照Real-time PCR試劑盒說明書要求，取cDNA 2 μL，然后依次加入ddH2O，SYBR Premix Ex Taq(2×)，上下游引物(各引物序列見表1)，PCR反應條件：95 ℃ 30 s； 40個PCR循環(95 ℃ 5 s； 60 ℃ 30 s)．所有反應均設立2個復孔．記錄每個反應管中標本的Ct值，以Gapdh為內參基因，通過2-ΔΔCt法計算各染毒組與對照組的CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9 mRNA的相對表達量.

表1 引物序列

1.2.6 Western Bolt法檢測大鼠睪丸CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9的蛋白表達情況

取-80 ℃凍存的睪丸組織60 mg，剪碎后加入裂解液，冰上勻漿并充分裂解30 min，然后離心(4 ℃，13 000 r/min，5 min)，取上清．以BCA法測定總蛋白濃度，每孔以50 μg總蛋白量上樣．12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V，1.5 h)，恒壓轉膜(20 V，40～70 min)，室溫封閉2.5 h，4 ℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗1 h，在暗室中用ECL法顯影．目標蛋白相對表達量用目標蛋白的灰度值與內參β-actin的灰度值比值表示.

1.2.7 TUNEL法檢測睪丸生殖細胞凋亡

本研究采用末端脫氧核酸轉移酶(TdT)介導dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測大鼠睪丸生殖細胞凋亡情況．該技術的原理是細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，剪切核小體間的基因組DNA，暴露出3’-OH，然后暴露的3’-OH可在TdT的催化下加上熒光素-12-脫氧三磷酸腺苷(FITC-12-dUTP)，而后即可通過熒光顯微鏡觀察生殖細胞的凋亡情況．檢測按試劑盒說明書進行，取睪丸石蠟切片(切片制作同睪丸組織病理形態學檢查)經脫蠟水合，滴加蛋白K酶工作液37 ℃作用25 min，滴加平衡液室溫平衡20 min，滴加TdT酶工作液37 ℃濕盒避光孵育60 min，滴加DAPI室溫避光孵育8 min進行染核，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，凋亡細胞呈強綠熒光．TUNEL反應陽性細胞計數是在熒光顯微鏡下(200×)每張切片隨機選取4個不同視野進行計數.

1.2.8 統計學處理

2 結 果

2.1 Fen對大鼠睪丸、 附睪質量及體質量的影響

如表2所示，與對照組相比，20 mg/kg和40 mg/kg組大鼠睪丸、 附睪質量及體質量均有所降低，但差異無統計學意義，p>0.05.

表2 Fen對大鼠睪丸、 附睪質量及體質量的影響

2.2 Fen對雄性SD大鼠附睪精子質量的影響

如表3所示，與對照組相比，20 mg/kg組精子總數、 各級精子活力及畸形率差異無統計學意義(p>0.05)； 40 mg/kg組附睪精子總數、 a級活力精子、 精子活動率及畸形率(精子畸形情況見圖1)差異有統計學意義(p<0.05或p<0.01).

表3 Fen對附睪精子數量、 活力及畸形率的影響

圖1 Fen染毒后導致的精子畸形情況

2.3 Fen對雄性SD大鼠血清及睪丸E2水平的影響

如圖2所示，與對照組相比，20 mg/kg組血清和睪丸中E2水平均未顯著增加(p>0.05)； 40 mg/kg組血清和睪丸中E2水平均顯著升高(p<0.05，p<0.01)．提示Fen具有提升雄性體內E2水平的作用，且這種作用隨Fen染毒劑量的增加而加強.

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統計學意義．圖2 Fen對血清及睪丸E2水平的影響

2.4 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達水平均隨染毒劑量增加而上調，CYP19A1 mRNA表達水平在20 mg/kg和40 mg/kg組均極顯著上調(p<0.01)； ERβ mRNA表達水平在20 mg/kg組差異無統計學意義(p>0.05)，在40 mg/kg組差異有統計學意義(p<0.01)，提示Fen具有上調雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ基因表達的作用.

與對照組相比，**表示p<0.01，差異有統計學意義．圖3 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達的影響

2.5 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組相比，雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達水平均隨染毒劑量增加而增加，CYP19A1在20 mg/kg組和40 mg/kg組差異均有統計學意義(p<0.05，p<0.01)； ERβ在20 mg/kg差異無統計學意義(p>0.05)，在40 mg/kg組差異有統計學意義(p<0.01)，提示Fen具有上調雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達的作用.

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統計學意義．圖4 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達的影響

2.6 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2 mRNA表達情況的影響

如圖5所示，與對照組相比，雄鼠睪丸Bax，Caspase 3及Caspase 9 mRNA表達水平均隨染毒劑量增加而上調，Bcl-2 mRNA表達水平隨染毒劑量增加而下調，Bax，Caspase 3及Caspase 9 mRNA表達水平在40 mg/kg組均極顯著上調(p<0.01)，Bcl-2 mRNA表達水平在20 mg/kg組顯著下調(p<0.05)，在40 mg/kg組極顯著下調(p<0.01).

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統計學意義．圖5 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2 mRNA表達情況的影響

2.7 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，雄鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9蛋白表達水平均隨染毒劑量增加而上調，Bcl-2蛋白表達水平隨染毒劑量增加而下調，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2蛋白表達水平在40 mg/kg組差異有統計學意義(p<0.01)； Bax蛋白表達水平在20 mg/kg和40 mg/kg組差異均有統計學意義(p<0.05，p<0.01).

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統計學意義．圖6 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2蛋白表達的影響

2.8 Fen對雄性SD大鼠睪丸曲細精管中生精細胞凋亡的影響

如圖7顯示，與對照組相比，Fen染毒組雄鼠睪丸生殖細胞凋亡數量(1個視野中)增加，在40 mg/kg組差異有統計學意義(p<0.01)，提示隨著Fen染毒劑量的增加，雄鼠睪丸生殖細胞凋亡逐漸增多.

藍色熒光為細胞核(DAPI染色)，綠色熒光為凋亡細胞(箭頭所示)．與對照組相比，**表示p<0.01，差異有統計學意義．圖7 Fen對雄性SD大鼠睪丸生殖細胞凋亡情況的影響

2.9 Fen對雄性SD大鼠睪丸病理結構的影響

如圖8所示，對照組大鼠曲細精管結構完整，生精細胞數量多，排列緊密； 20 mg/kg組大鼠睪丸曲細精管生精細胞數量減少，部分曲細精管出現了較為嚴重的生精細胞缺失(箭頭所示)； 40 mg/kg組大鼠睪丸曲細精管生精細胞數量進一步減少，可見部分曲細精管生精細胞排列紊亂，生精細胞缺失嚴重，管腔內精子較少.

圖8 Fen對睪丸曲細精管結構的影響

3 討 論

正常雄性生育能力的維持依賴于精子發生的有效進行．正常有效的精子發生既有賴于睪丸中的生精細胞、 支持細胞和間質細胞之間的密切協調，又受到下丘腦-垂體-性腺軸的生殖內分泌調控，同時這兩個方面之間還相互協調、 相互依存，彼此密不可分．在生殖內分泌調控中，雄性精子發生主要受黃體生成素介導的睪酮分泌的調控，但雌激素在雄性精子發生過程中也同樣起著不可或缺的作用．研究顯示，適量的雌激素在雄性生殖中具有促進精子發生、 抑制生殖細胞凋亡、 提高精子受精能力等作用[8-10]，而雄性體內雌激素的含量過低或過高均會引起雄性精子發生異常以及生殖能力下降[11-12].

在藥理學和毒理學中，體質量及臟器系數是一個關鍵的毒性觀察指標．結果顯示，青春期雄性SD大鼠暴露于Fen后，大鼠的體質量及附睪和睪丸的臟器系數均出現減小的趨勢，但差異均無統計學意義，這表明本研究中Fen的劑量對雄鼠整體的生長情況并未產生太大的影響.

精子質量是衡量雄性生殖能力的重要指標[13]．在精子發生的過程中，各級生精細胞對有毒化學物質的作用十分敏感，易受到有毒化學物質的干擾而導致精子的數量減少和活力降低．本研究的結果表明，Fen染毒后，各染毒組精子數量、 精子活力和精子活動率均較對照組降低，精子畸形率較對照組增加，且在40 mg/kg組差異有統計學意義，這與Zhang等[14]的研究結果一致．這說明Fen對雄性的生殖能力具有損害作用.

雌二醇(E2)是雄性體內最主要的雌激素．本研究的結果表明，在Fen連續染毒30 d(兩個生精上皮周期)后，雄性大鼠血清和睪丸中E2含量均較對照組增高，并且在40 mg/kg組，二者差異均有統計學意義，這表明Fen可促進雄性體內E2的生成，提高雄鼠體內雌激素的水平．Carreau等[11]研究發現，雄性睪丸中雌激素水平過高會引起雄性精子發生異常，使精子質量降低，導致雄性生殖能力下降．這提示我們Fen可通過增加雄性睪丸中雌激素的水平而損害雄性生殖功能.

雄性體內的E2由雄激素在睪丸中轉化而來，芳香化酶(CYP19A1)是這一轉化過程中的關鍵酶．CYP19A1在雄性睪丸間質細胞、 生精細胞及精子中均有表達[15]．以往的研究發現，CYP19A1在雄性體內低表達或過度表達均會引起雄性精子發生異常，使精子數量減少和活力降低，導致雄性生殖損傷甚至不育[6，12，16-18]，這主要與CYP19A1表達異常致使雄性睪丸內E2合成不足或過量有關[11-12]．本研究中各染毒組睪丸CYP19A1的mRNA和蛋白表達水平較對照組均顯著增加，這與Fen染毒后引起血清和睪丸中E2含量增加的研究結果相一致．這表明Fen是通過誘導睪丸中CYP19A1的表達，促進雄激素轉化為雌激素，從而升高雄性睪丸中雌激素水平的.

雌激素發揮其生理作用需通過其特異性受體(雌激素受體，ERs)的介導．ERs屬于激素核受體超家族的成員，其主要包括ERα和ERβ兩種亞型，其中ERβ主要分布于成熟雄性大鼠的支持細胞和生精細胞[19，20]，對維持正常雄性生殖能力發揮著十分重要的作用．Delbes等[21]研究發現，敲除小鼠ERβ可促進小鼠生殖母細胞的增殖同時抑制其凋亡； Gould等[22]和Dumasis等[23]發現，ERβ受體激動劑可促進生精細胞的凋亡．我們的研究結果顯示，Fen可誘導大鼠睪丸中ERβ的mRNA和蛋白高表達，并且40 mg/kg組與對照組相比差異有統計學意義(p<0.01)．同時，我們還發現，隨著ERβ的表達量升高，雄性大鼠曲細精管發生凋亡的生精細胞比例也逐漸增加，這與Xie等[24]以及Qu等[25]用雙酚a、 全氟辛烷磺酸等其他環境內分泌干擾物研究的結果相一致．這些結果提示我們，Fen可能通過誘導雄鼠睪丸中ERβ的表達，過度增強ERβ信號作用，而促進生精細胞的凋亡，使曲細精管中生精細胞數量和管腔內精子數量減少，但ERβ引起生精細胞凋亡的機制尚不清楚.

線粒體凋亡途徑是細胞最重要的凋亡途徑之一，在各種外源性病理刺激條件下，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白(如Bax，Bad等)發生去磷酸化，與線粒體膜上的抗凋亡蛋白(如Bcl-2，Bcl-XL等)結合，而開啟線粒體膜通透性轉換孔，導致凋亡相關因子，如細胞色素C、 凋亡誘導因子等從線粒體內釋放進入胞漿，激活Caspase家族的凋亡啟動者Caspase 9，Caspase 9激活后能引起Caspase級聯反應，最終激活凋亡執行者Caspase 3，而引起細胞凋亡[26-28]．我們的研究結果顯示，Fen染毒上調了大鼠睪丸中促凋亡基因Bax，Caspase 3及Caspase 9 mRNA和蛋白的表達水平，同時抑制了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白的表達．這些結果似乎提示我們，Fen誘導的雄鼠睪丸ERβ過度升高可能與線粒體凋亡途徑的激活之間存在著某種聯系，但具體機制還有待進一步研究.

綜上所述，我們猜測Fen通過上調雄性大鼠睪丸中CYP19A1和ERβ的表達，致使睪丸E2水平升高的同時，又過度增強E2-ERβ信號作用，后者通過某種機制激活線粒體凋亡途徑，從而引起生殖細胞的過度凋亡，精子發生異常，精子數量和活力降低，畸形精子增多，最終導致雄性大鼠的生殖損傷．然而Fen是通過何種機制上調雄性大鼠睪丸中CYP19A1和ERβ的表達水平以及ERβ的高表達是否與生殖細胞線粒體凋亡途徑的激活有關，這些問題都還有待今后進一步明確.