苗藥烏蕨HPLC特征指紋圖譜研究

陳 明，段 萍

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558013；2.黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 都勻 558000)

烏蕨(Stenolomachusanum(L.) Ching)為鱗始蕨科烏蕨屬的多年生草本植物，又名烏韭、雉雞尾、大葉金花草、石青葦，分布于長(zhǎng)江流域以南各省份，且蘊(yùn)藏量較大。在民間有“萬(wàn)能解毒藥”之稱，具有確切的療效和悠久的臨床用藥歷史。迄今對(duì)烏蕨化學(xué)成分[1]、藥理作用[2-3]以及質(zhì)量控制方法[4-5]的有關(guān)文獻(xiàn)較多，但特征指紋圖譜的研究未見(jiàn)報(bào)道，為更全面控制烏蕨藥材質(zhì)量，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]采用HPLC 法建立了烏蕨藥材的特征指紋圖譜分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 梅特勒AG135、AL204電子天平， SK250LHC超聲波清洗器(上海科導(dǎo)儀器有限公司)，島津2401紫外分光光度計(jì)，Agilent 1260 DAD VL高效液相色譜儀。處理軟件為“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)( 2012-130723版)”(以下簡(jiǎn)稱“相似度評(píng)價(jià)軟件”)。

1.2 試藥 對(duì)照品葒草苷(批號(hào)：111777-201302)、牡荊素鼠李糖苷(批號(hào)：111668-200602)、牡荊素(批號(hào)：111687-201603)、木犀草苷(批號(hào)：111720-201106)、原兒茶酸(批號(hào)：110809-201205)、原兒茶醛(批號(hào)：110810-200205)、香草酸(批號(hào)：110776-200402)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司色譜純、分析純)，娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

收集到不同產(chǎn)地的烏蕨20批(見(jiàn)表1)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)何順志教授鑒定為鱗始蕨科烏蕨屬Stenolomachusanum(L.) Ching的干燥品。采割地上部分晾干，粉碎，過(guò)3號(hào)篩，置干燥器中保存，備用。

表1 烏蕨樣本表

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷、原兒茶醛、原兒茶酸、香草酸適量，精密稱定，加65%乙醇分別制成每1 ml含上述對(duì)照品各1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加65%乙醇制成每1 ml含葒草苷、牡荊素、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷、原兒茶醛、原兒茶酸、香草酸分別為4.18、17.51、24.84、5.91、10.62、17.00、8.71 μg/ml的對(duì)照品混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末2.0 g，精密稱定，置于200 ml 具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇50 ml，稱定重量，超聲提取30 min (頻率53 KHz) 后，水浴加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試液。

2.3 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.4% 磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～10 min，8%→10%A；10～15 min，10%→18%A；15～36 min，18%A；36～37 min，18%→8%A；37～46 min，8%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μl；流速1 ml/min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S1號(hào)供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，采用 “相似度評(píng)價(jià)軟件”進(jìn)行分析，符合中藥特征色譜的要求。選用葒草苷色譜峰為參照峰，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值，共有峰相對(duì)峰面積RSD≤1.2%，相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.5%，表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)需求。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取S1號(hào)樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)，用“相似度評(píng)價(jià)軟件”進(jìn)行分析，6份色譜圖的相似度為1，符合中藥特征色譜的要求。以葒草苷峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積、相對(duì)保留時(shí)間的RSD，均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)供試品溶液，分別于0、5、15、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，以葒草苷為參照峰，分別計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果表明，共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均≤2.0%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 烏蕨HPLC指紋圖譜的建立 取20批烏蕨藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖。將20批烏蕨的HPLC色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“相似度評(píng)價(jià)軟件”，選擇S1號(hào)樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正，色譜峰全峰自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法(時(shí)間窗寬度為0.1)生成烏蕨對(duì)照特征圖譜(R)。烏蕨HPLC的對(duì)照品圖譜、對(duì)照特征圖譜及20批烏蕨樣品特征圖譜的匹配圖分別見(jiàn)圖1、2、3。葒草苷的出峰時(shí)間居中，峰面積較大，分離度較好，因此選取該峰作為參照峰(S)，計(jì)算20批烏蕨樣品各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，RSD均≤0.6%，表明所得烏蕨指紋圖譜可信度較高。

圖1 對(duì)照品HPLC圖譜

2.6 烏蕨藥材相似度評(píng)價(jià) 20批樣品的特征圖譜分析結(jié)果，烏蕨中主要有11個(gè)共有峰，確認(rèn)出6個(gè)色譜峰，分別為原兒茶酸、原兒茶醛、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷，相對(duì)保留時(shí)間分別為0.337、0.503、1.000、1.083、1.217，RSD均≤0.6%。色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“相似度評(píng)價(jià)軟件”，以烏蕨對(duì)照特征圖譜(R)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算20批樣品與對(duì)照特征色譜圖的相似度，結(jié)果在0.855～0.957之間，表明相似度較好。見(jiàn)表2。

圖2 烏蕨的對(duì)照特征圖譜(R)

圖3 20批烏蕨的特征圖譜

表2 樣本相似度評(píng)價(jià)

3 討論

3.1 波長(zhǎng)選擇 考察280、254、350 nm波長(zhǎng)下的各色譜峰，280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)到的色譜峰信息較全面，且各色譜峰的峰形及分離度較好，因此最終選擇280 nm作為烏蕨HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相選擇 嘗試選擇乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸及乙腈-0.4%磷酸3種流動(dòng)相進(jìn)行HPLC 梯度洗脫分析，結(jié)果顯示，乙腈-水、甲醇-0.1%醋酸所得色譜峰較多，但部分峰的峰形、分離度較差，乙腈-0.4%磷酸所得峰形、主要成分分離度較好，故選擇乙腈-0.4%磷酸作為烏蕨HPLC分析測(cè)定的流動(dòng)相。

3.3 云、貴、川、桂、湘采集的20個(gè)不同批次的烏蕨雖有差異，但相似度均≥0.85，可作為烏蕨藥材的質(zhì)量控制方法。

綜上所述，本文采用HPLC特征指紋圖譜分析方法初步建立了苗藥烏蕨質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)有關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)一步研究開發(fā)苗藥烏蕨有一定參考作用。