門冬氨酸鳥氨酸聯(lián)合奧拉米特對(duì)急性肝衰竭大鼠肝功能的影響

李晶晶，張文馨，張 倩，劉艷月，谷紅麗，萬菲菲，王 晶

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科 鄭州 450052

肝衰竭是臨床常見的危重癥之一，病死率高達(dá)70%～80%[1]；目前肝衰竭的治療包括去除病因，對(duì)癥、支持治療和維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(如人工肝)，干細(xì)胞或肝細(xì)胞移植，最終部分患者依賴于肝移植。“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為體內(nèi)免疫應(yīng)答過強(qiáng)、內(nèi)毒素血癥、細(xì)胞因子紊亂等多種因素與肝衰竭發(fā)生有關(guān)；肝衰竭時(shí)大量肝細(xì)胞壞死和凋亡，肝細(xì)胞功能受損，“殘存”肝細(xì)胞不能滿足身體代謝的需要，引起血氨升高、乳酸中毒、血糖紊亂、吲哚水平增高等一系列代謝紊亂；而繼發(fā)血氨升高可以再次誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷[2-5]。氨在體內(nèi)聚集，還可透過血腦屏障干擾腦能量代謝，從而引起肝性腦病[6-7]。因此如何調(diào)整體內(nèi)代謝途徑(如降低血氨)是目前肝衰竭治療研究的熱點(diǎn)[8]。門冬氨酸鳥氨酸(ornithine aspartate，OA)為常用降血氨藥物[9]。奧拉米特是一種乳清酸鹽，可改善清蛋白、白蛋白及血清總蛋白的水平[10]。血氨代謝通路主要有氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,CPS) Ⅰ途徑和CPS Ⅱ途徑，CPS Ⅰ是血氨代謝通路中尿素循環(huán)的限速酶，CPSⅡ是CPS Ⅰ的同工酶，其主要參與嘧啶合成。人體內(nèi)氨代謝通過CPS Ⅰ途徑即鳥氨酸循環(huán)將有毒的氨合成尿素由腎臟排出體外。肝衰竭后，CPS Ⅰ途徑受抑制，導(dǎo)致體內(nèi)血氨蓄積，從而引發(fā)CPSⅡ途徑，合成大量嘧啶，使體內(nèi)氨濃度進(jìn)一步增高，加重肝衰竭[11]。本研究中，我們觀察了經(jīng)OA降血氨及奧拉米特補(bǔ)充乳清酸治療后，急性肝衰竭大鼠血氨、血乳酸濃度、肝功能指標(biāo)、肝臟病理組織學(xué)變化，及肝組織中CPS Ⅰ、Ⅱ蛋白表達(dá)情況，探討OA聯(lián)合奧拉米特治療肝衰竭的效果及可能機(jī)制，為肝衰竭的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器設(shè)備清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重(200±20) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(豫)2011-0001。OA購自武漢啟瑞藥業(yè)有限公司，奧拉米特購自湖南中南制藥有限責(zé)任公司，脂多糖、D-氨基半乳糖購自Sigma-Aldrich(中國)。乳酸測(cè)定試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司，肝功能生化檢測(cè)試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司。羊抗兔CPSⅠ、Ⅱ，鼠抗羊二抗購自美國Abcam公司，HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。邁瑞B(yǎng)S-820型全自動(dòng)生化分析儀，BS124S型電子分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組40只雄性SD大鼠中，隨機(jī)選取32只腹腔注射D-氨基半乳糖700 mg/kg聯(lián)合脂多糖3 μg/kg以建立急性肝衰竭大鼠模型[12]；余8只大鼠腹腔注射生理鹽水5 mL/kg，為正常對(duì)照組。造模的32只大鼠，分4組處理，每組8只，分別于造模前24、16、8 h，以及造模后8、16 h灌胃給予生理鹽水5 mL/kg(模型對(duì)照組)、OA 1.0 g/kg(OA組)、奧拉米特36 mg/kg(奧拉米特組)、OA+奧拉米特(聯(lián)合干預(yù)組)。剔除造模過程中死亡大鼠。最后一次灌胃24 h后進(jìn)行標(biāo)本的采集及指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 血氨、乳酸濃度及肝功能指標(biāo)的檢測(cè)戊巴比妥麻醉大鼠，心臟采血，檢測(cè)血氨、乳酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)、血清白蛋白(ALB)濃度。

1.4 大鼠肝組織病理學(xué)觀察及CPSⅠ、CPSⅡ蛋白表達(dá)的檢測(cè)取肝右葉下部組織，用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3～5 μm厚切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織學(xué)形態(tài)。將制備好的大鼠肝組織切片脫蠟脫水后，檸檬酸鈉抗原修復(fù)3 min，PBS沖洗后加入體積分?jǐn)?shù)3%H2O2處理10 min，加入山羊血清于濕盒中封閉10 min；加入羊抗兔CPSⅠ和CPSⅡ抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育；次日PBS沖洗后加入二抗室溫孵育10 min，PBS沖洗，DAB染色，蘇木精復(fù)染，晾干后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。CPSⅠ、CPSⅡ陽性細(xì)胞的表現(xiàn)為胞質(zhì)呈黃褐色顆粒。每只任選5個(gè)視野(×400)分別計(jì)數(shù)CPSⅠ、CPSⅡ陽性細(xì)胞，取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；模型對(duì)照組、OA組、奧拉米特組及聯(lián)合干預(yù)組各指標(biāo)的分析采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 急性肝衰竭大鼠模型的構(gòu)建與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肝功能指標(biāo)均增高，提示急性肝衰竭大鼠模型造模成功。模型對(duì)照組大鼠血氨和乳酸濃度均高于正常對(duì)照組，提示急性肝衰竭大鼠體內(nèi)代謝異常。模型對(duì)照組大鼠肝組織中CPS Ⅰ蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，CPS Ⅱ蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，提示急性肝衰竭大鼠尿素合成途徑受抑制。見表1。

表1 正常對(duì)照組和模型對(duì)照組各指標(biāo)的比較

2.2 肝組織病理表現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝索呈放射狀排列，無肝細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象(圖1A)；模型對(duì)照組大鼠可見彌漫性肝細(xì)胞壞死，肝竇出血，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(圖1B)；奧拉米特組與模型對(duì)照組比較未見明顯差別(圖1D)；OA組(圖1C)及聯(lián)合干預(yù)組(圖1E)相較于模型對(duì)照組，肝臟病變相對(duì)較輕，壞死面積較小，可見殘存的肝小葉結(jié)構(gòu)。

A～E:分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、OA組、奧拉米特組、聯(lián)合干預(yù)組

2.3 模型對(duì)照組與各干預(yù)組大鼠血氨、乳酸濃度的比較見表2。OA組及聯(lián)合干預(yù)組血氨和乳酸濃度均較模型對(duì)照組降低，聯(lián)合干預(yù)組降低最為顯著，表明OA可以改善模型大鼠的代謝，奧拉米特可以協(xié)調(diào)增效OA的改善作用。

表2 4組血氨、乳酸濃度的比較

2.4 模型對(duì)照組與各干預(yù)組大鼠肝功能指標(biāo)的比較見表3。OA和奧拉米特均可改善模型大鼠肝功能，兩者聯(lián)合，協(xié)同增效。

表3 4組肝功能指標(biāo)的比較

2.5 模型對(duì)照組與各干預(yù)組大鼠肝組織中CPS Ⅰ、CPS Ⅱ表達(dá)的比較見圖2、表4。與模型對(duì)照組比較，OA組和聯(lián)合干預(yù)組大鼠肝組織中CPS Ⅰ表達(dá)升高，OA組、奧拉米特組和聯(lián)合干預(yù)組CPS Ⅱ表達(dá)降低，聯(lián)合干預(yù)組變化更顯著。

A～E:分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、OA組、奧拉米特組、聯(lián)合干預(yù)組CPS Ⅰ的表達(dá)；F～J:分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、OA組、奧拉米特組、聯(lián)合干預(yù)組CPS Ⅱ的表達(dá)

表4 4組大鼠肝組織中CPSⅠ、CPS Ⅱ表達(dá)的比較

3 討論

肝衰竭是一個(gè)多因素誘發(fā)的，多機(jī)制推動(dòng)的級(jí)聯(lián)病理過程，誘發(fā)因素以炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素血癥和缺血缺氧最為常見，繼而引起體內(nèi)血氨升高，高血氨嚴(yán)重影響急性肝衰竭的預(yù)后[6,12-13]。有研究[14]表明，肝衰竭患者血液中含有多種毒素，其中多數(shù)來源于腸道細(xì)菌的分解產(chǎn)物，包括硫化氫、氨等，這些有毒物質(zhì)不能被及時(shí)代謝，再次被吸收入血，則加重肝細(xì)胞的損傷。氨在血液中主要以NH4+離子形式存在，通過NH4+受體進(jìn)入細(xì)胞，最后在線粒體內(nèi)通過尿素循環(huán)以尿素形式排出體外。血氨代謝通路主要有CPS Ⅰ及CPS Ⅱ途徑。CPS Ⅰ是尿素循環(huán)的限速酶，N-乙酰谷氨酸是其正調(diào)節(jié)物，N-乙酰谷氨酸缺乏時(shí)CPS Ⅰ幾乎沒有活性。CPS Ⅱ在細(xì)胞質(zhì)中，與嘧啶核苷酸的合成有關(guān)，不受N-乙酰谷氨酸調(diào)控。正常人體內(nèi)血氨代謝以CPS Ⅰ途徑為主，即主要通過鳥氨酸循環(huán)合成尿素由腎臟排出體外[15]。如何調(diào)整體內(nèi)免疫應(yīng)答，減少內(nèi)毒素吸收或者改善肝臟缺血缺氧，通過尿素循環(huán)降低體內(nèi)血氨等都是目前肝衰竭治療研究的熱點(diǎn)[16]。

本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠肝臟酶學(xué)指標(biāo)(ALT、AST)及膽紅素水平(TB、DB)均較正常對(duì)照組升高，血氨和乳酸濃度升高，肝組織中CPS Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低，CPS Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高。因此推測(cè)急性肝衰竭大鼠體內(nèi)尿素合成途徑受抑制，血氨代謝異常，導(dǎo)致氨在體內(nèi)蓄積，從而引起一系列肝臟損傷。

OA為常用降血氨藥物，可促進(jìn)ATP生成[6]。奧拉米特作為一種乳清酸鹽，為嘌呤及嘧啶衍生物前體，可促進(jìn)核酸代謝平衡，并在體內(nèi)合成核酸，糾正蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、葡萄糖的代謝異常，同時(shí)有效防止肝細(xì)胞壞死和肝纖維化，刺激肝細(xì)胞再生，活化肝細(xì)胞，改善清蛋白、白蛋白及血清總蛋白的水平[17]。本研究結(jié)果顯示，OA可以降低急性肝衰竭模型大鼠血氨和乳酸濃度，改善模型大鼠的代謝功能、肝功能和肝臟病理表現(xiàn)，升高肝組織中CPS Ⅰ的表達(dá)，降低CPS Ⅱ表達(dá)；奧拉米特單獨(dú)作用雖僅可改善模型大鼠的肝功能，但奧拉米特可以協(xié)同OA進(jìn)一步改善模型大鼠的代謝功能、肝功能和肝臟病理表現(xiàn)，升高肝組織中CPS Ⅰ的表達(dá)和降低CPS Ⅱ表達(dá)。本研究結(jié)果提示OA及奧拉米特聯(lián)用，可以通過平衡體內(nèi)代謝、降低血氨濃度，減輕血氨對(duì)肝臟的損傷。

由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本實(shí)驗(yàn)存在一些不足之處：①本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的大鼠模型血氨濃度在200 μmol/L左右，而臨床實(shí)際中肝衰竭患者血氨水平可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個(gè)水平，所以本研究結(jié)論還需要臨床上的進(jìn)一步驗(yàn)證。②檢測(cè)的指標(biāo)為常規(guī)生化指標(biāo)，未從細(xì)胞因子、mRNA等水平切入進(jìn)行深入研究，在機(jī)制探討方面仍有很大的不足。

綜上所述，降血氨藥物OA及保肝藥物奧拉米特聯(lián)合應(yīng)用有可能成為重癥肝病治療的有效方法。進(jìn)一步探討兩者的肝臟保護(hù)以及血氨代謝通路調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，將對(duì)肝衰竭尤其是肝性腦病的治療提供科學(xué)依據(jù)及新的思路，具有重要的指導(dǎo)意義。