Hsa_circ_0000880在阿爾茲海默病患者血漿中的表達(dá)及診斷價(jià)值

崔 健，李婧靜，李飛翔，李樹強(qiáng)，朱洪山，朱 寧，聞 君，劉偉利，陳艷艷，吳 睿

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科 鄭州 450014

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是世界范圍內(nèi)常見的神經(jīng)退行性疾病，已成為老年人癡呆最常見的病因之一[1]。AD起病隱匿，患者認(rèn)知和記憶功能持續(xù)惡化，出現(xiàn)行為異常、人格改變及社會(huì)行為混亂[2]。該病通常呈進(jìn)行性加重，患者逐漸喪失獨(dú)立生活的能力。AD的致死率和致殘率很高，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[3]。雖然AD的診斷和治療已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但其分子發(fā)病機(jī)制仍未闡明[4]。對(duì)其潛在機(jī)制的進(jìn)一步研究，可以幫助人們更加深刻地了解AD，以促進(jìn)有效治療策略的制定。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類在大腦中富集的特殊單鏈非編碼RNA[5]。circRNA具有共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)，無(wú)5’-3’極性以及poly(A)，可特異性吸附微小RNA(miRNA)，作為內(nèi)源分子海綿，調(diào)控miRNA的表達(dá)，發(fā)揮其獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)[6-7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，circRNA通過(guò)直接吸附miRNA，在包括AD在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病中發(fā)揮特殊作用。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)參與了AD的發(fā)病過(guò)程。有研究[9]證實(shí)circRNA-7是miRNA-7分子海綿，調(diào)節(jié)散發(fā)性AD海馬大腦中UBE2A和EGFR的代謝過(guò)程。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-214-3p在SAMP8小鼠腦組織顯著下降，與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，miR-214-3p對(duì)神經(jīng)元凋亡和自噬有抑制作用。該研究分析了AD患者血漿及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中hsa_circ_0000880和miR-214-3p的表達(dá),探討hsa_circ_0000880作為AD診斷的生物標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 病例選擇選取2018年5月至2019年5月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的AD患者28例(AD組)，年齡70～90(78.1±5.6)歲，男18例，女10例，診斷參照IWG-2[11]標(biāo)準(zhǔn)，排除急性心肌梗死、帕金森病、癌癥和多發(fā)性硬化者[12-14]。招募28名健康人作為正常對(duì)照(對(duì)照組)，年齡70～90(77.4±5.9)歲，男18名，女10名。經(jīng)常規(guī)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查、簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE)評(píng)分、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估(MoCA)評(píng)分等，確定對(duì)照組的神經(jīng)功能正常[15]。高血壓、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高脂血癥均根據(jù)現(xiàn)行臨床標(biāo)準(zhǔn)[16-19]診斷。所有受試者均被告知受試目的并且簽署知情同意書。本試驗(yàn)方案均經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血漿hsa_circ_0000880和miR-214-3p水平的qRT-PCR檢測(cè)采集AD組及對(duì)照組受試者空腹8 h后的外周血2.5 mL，立即4 ℃條件下4 000×g離心15 min。分離后的血漿于-80 ℃保存。使用RNeasy mini kit(德國(guó)Qiagen公司)從血漿中提取總RNA。根據(jù)Circbank(http://www.circbank.cn/)獲得的circRNA序列并擴(kuò)增引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(日本TaKaRa公司)合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司)進(jìn)行hsa_circ_0000880檢測(cè)。Hsa_circ_0000880上游引物序列5’-TCCGACAGAAAAGAGTGCGA-3’，下游引物序列5’-AATCCATAGCATCGAGCCCC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物序列5’-GGCGATGCTG GCGCTGAGTAC-3’，下游引物序列5’- GAGGCTGT TGTCATACTTCTC-3’。反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物及ROX Reference Dye Ⅱ各0.4 μL、DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 30 s, 退火及延伸60 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。使用Hairpin-it MicroRNAs定量PCR試劑盒(上海Gene Pharma公司產(chǎn)品)進(jìn)行miR-214-3p檢測(cè)。miR-214-3p上游引物序列5’-GCCGAGACAGCAGGCACA-3’，下游引物序列5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；內(nèi)參U6 上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)體系：2×Real-time PCR Buffer 10 μL,上、下游引物各0.3 μL，miRNA RT product 2 μL，Tag酶0.2 μL，加雙蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 12 s，退火/延伸58 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法分析hsa_circ_0000880和miR-214 -3p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1細(xì)胞和主要試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y和293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó) Type Culture Collection。293T細(xì)胞使用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清和青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，SH-SY5Y使用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2及體積分?jǐn)?shù)95%相對(duì)濕度。Hsa_circ_0000880 siRNA(si-Circ)、對(duì)照siRNA(si-NC)、miR-214-3p mimic和對(duì)照miRNA(miR-NC)均購(gòu)自中國(guó)上海GenePharma公司，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)用載體pmirGLO和檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega(北京)公司，Lipofectamine 3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3.2雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用PCR法擴(kuò)增從AD患者血漿中提取的包含miR-214-3p結(jié)合位點(diǎn)的的野生型hsa_circ_0000880片段(Circbank數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè))，并使用重疊擴(kuò)增PCR法構(gòu)建并擴(kuò)增結(jié)合位點(diǎn)突變的突變型hsa_circ_0000880片段，然后將野生型或變異型hsa_circ_0000880分別克隆到pmirGLO載體得到pmirGLO-Wt-circ_0000880(Wt-circ_0000880)或pmirGLO-Mut-hsa_circ_0000880(Mut-circ_0000880)。根據(jù)說(shuō)明書的方法使用Lipofectamine 3000 將載體和miR-214-3p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，孵育24 h后，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.3.3抑制hsa_circ_0000880表達(dá)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞miR-214-3p表達(dá)的影響 SH-SY5Y細(xì)胞以每孔4×105個(gè)的密度接種于6孔板，分為si-Circ和si-NC組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNA。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。應(yīng)用qRT-PCR法(同1.2)進(jìn)行miR-214-3p表達(dá)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0分析。兩組臨床特征和血漿hsa_circ_0000880水平、si-Circ和si-NC組SH-SY5Y細(xì)胞中miR-214-3p表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。采用ROC曲線評(píng)估hsa_circ_0000880對(duì)AD的診斷價(jià)值。AD患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE、MoCA評(píng)分，miR-214-3p的相關(guān)關(guān)系采用Peason相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床特征比較見表1。AD組MMSE和MoCA評(píng)分低于對(duì)照組。

表1 兩組的臨床特征比較

2.2 兩組血漿hsa_circ_0000880水平比較AD組血漿hsa_circ_0000880水平為(2.967±0.886)，較對(duì)照組(1.539±0.558)明顯升高(t=7.210，P=0.015)。

2.3 血漿hsa_circ_0000880對(duì)AD診斷的ROC曲線分析ROC曲線見圖1。AUC為0.886，95%CI為0.773～0.999，取截?cái)嘀禐?.395時(shí)，其診斷的敏感度為73.7%，特異度為94.7%。

圖1 hsa_circ_0000880診斷AD的ROC曲線

2.4 AD患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE、MoCA評(píng)分相關(guān)性AD患者血漿hsa_circ_0000880水平和MMSE、MoCA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.646和-0.601,P<0.001)。

2.5 AD患者血漿miR-214-3p與hsa_circ_0000880水平的相關(guān)性AD患者血漿miR-214-3p水平為(0.551±0.192)，與hsa_circ_0000880水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.053,P=0.002)。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 抑制hsa_circ_0000880表達(dá)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞miR-214-3p表達(dá)的影響si-Circ組細(xì)胞中miR-214-3p相對(duì)表達(dá)水平為(2.362±0.162)，較si-NC組(1.000±0.052)升高(t=17.909,P=0.048)。

3 討論

非編碼RNA因其獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng),可能與AD的病理機(jī)制(如淀粉樣蛋白沉著病、突觸缺失和神經(jīng)元凋亡)有關(guān)[5，20]。Feng等[21]在AD患者血漿中發(fā)現(xiàn)LncRNA BACE1水平升高，BACE1可能成為預(yù)測(cè)AD的潛在生物標(biāo)志物。有研究[11]表明經(jīng)Aβ25～35蛋白誘導(dǎo)處理的SH-SY5Y細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)下調(diào)，并且miR-133b可以作為特異性的生物標(biāo)志用于AD的早期診斷，其敏感性高達(dá)90.8%。該研究結(jié)果顯示AD患者血漿hsa_circ_0000880水平明顯高于對(duì)照組。此外，hsa_circ_0000880診斷AD的ROC曲線的AUC為0.886，95%CI為0.773～0.999，截?cái)嘀禐?.935時(shí)，其敏感度為73.7%，特異度為94.7%，提示hsa_circ_0000880在診斷AD方面可能具有較高的價(jià)值。

MMSE和MoCA評(píng)分一般用于各類認(rèn)知障礙和癡呆的初步篩查[22]。臨床上通常聯(lián)合檢測(cè)兩者，可提高認(rèn)知障礙的檢出率，提高認(rèn)知篩查的準(zhǔn)確性。一般來(lái)說(shuō)，MMSE和MoCA得分越低，病情越嚴(yán)重[23]。該研究結(jié)果表明AD組患者血漿hsa_circ_0000880水平與MMSE/MoCA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示隨著AD病情的加重，血漿hsa_circ_0000880水平呈上升趨勢(shì)。

最近的研究表明circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程的許多方面起著關(guān)鍵作用。最近的研究[9，24]表明，ciRS-7-miRNA-7-ube2a通路在海馬AD大腦組織中存在異常，表明了ciRS-7對(duì)miRNA-7的“海綿吸附作用”。Yang等[25]發(fā)現(xiàn)circ_0000950可以通過(guò)靶向調(diào)控miR-103，增加PTGS2的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元增殖，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。Lu等[26]發(fā)現(xiàn)circHDAC9-miR-138-Sirt1在AD的認(rèn)知損傷和病理過(guò)程中有潛在作用。本研究的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明has_circ_0000880與miR-214-3p有靶向關(guān)系。基于以上發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)hsa_circ_0000880可能通過(guò)下調(diào)miR-214-3p的表達(dá)在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

綜上所述，AD患者血漿hsa_circ_0000880在水平升高，可能通過(guò)直接吸附miR-214-3p，參與AD的病理過(guò)程，hsa_circ_0000880可作為AD診斷的生物標(biāo)志物。