花后低溫對小麥胚形態發育的影響

余徐潤，顧清欽，冉莉萍，姚慧慧，臧 勇，熊 飛

(1.江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現代產業技術協同創新中心/揚州大學教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，揚州大學，江蘇揚州 225009； 2.揚州大學廣陵學院，江蘇揚州 225128)

胚是小麥籽粒最重要的器官之一，由胚芽、包裹在胚芽外的胚芽鞘、胚根、包在胚根外的胚根鞘、胚軸和子葉組成，在谷物萌發過程中對器官再生起重要作用[1]。小麥胚約占種子總重量的2.5%～3.8%，是制粉工業的重要副產品，含有豐富的碳水化合物、蛋白質和脂肪,另外還含有維生素、礦物質、黃酮類物質和凝集素等多種保健因子，是濃縮營養素的獨特來源[2-3]。胚的大小和胚乳貯藏物質的含量是影響小麥幼苗活力的重要因素[4]。小麥胚在授粉后6～7 d 進入分化階段，最初由原胚分化出胚芽，然后出現胚芽鞘，同時胚根開始分化。分化階段大約在開花授粉后15 d結束。成熟胚包括有盾片、胚芽鞘、莖生長點、胚根、胚根鞘等部分[5]。

小麥的生長和發育容易受到各種生物和非生物脅迫的影響，例如干旱、鹽分、低溫等。Attila等[6]觀察了干旱脅迫對干旱敏感性和耐旱性小麥在授粉后第5～9 d籽粒形態、淀粉含量和籽粒產量的影響，結果表明，干旱脅迫下小麥胚面積減少，糊粉細胞的發育和胚珠周圍細胞層的降解速度明顯加快。魏松德等[7]發現，低溫處理后，小麥胚在萌發后期生長速度降低，且在低溫處理過程中，小麥胚的RNA和DNA含量均顯著增加。Attila等[8]和Liu等[9]研究發現，可溶性糖和脯氨酸有助于維持細胞內的滲透壓，并防止因冷應激而引起的原生質過度脫水。Zhang等[10]研究表明，冬小麥品種具有較強的滲透調節能力、光合作用能力和抗氧化酶活性恢復能力，以及較低的脂質過氧化水平。開花后穎果發育前期是小麥穎果灌漿的關鍵時期，在此時期遭遇低溫冷害，穎果發育會受到明顯影響。白光志等[11]研究發現，花期低溫處理抑制晚稻光合作用，4 d及以上的低溫處理顯著降低結實率，減慢籽粒灌漿過程，造成減產。因此，探明花后低溫對小麥胚形態發育的影響，能有效解析晚春霜凍害改變小麥品質的機理，但目前有關花后低溫對小麥胚形態發育的影響鮮有報道。本研究以耐寒性有差異的春性小麥和半冬性小麥品種為材料，利用樹脂半薄切片和顯微結構觀察，同時結合Image-Pro Plus軟件，系統分析了花后低溫處理下小麥胚外觀形態和內部顯微結構的變化，以期揭示花期低溫對小麥胚形態結構發育的影響，進一步豐富小麥生長發育對倒春寒的響應機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為春性小麥品種揚麥15和半冬性小麥品種煙農19，由江蘇省里下河地區農科所提供。2019-2020年度種植于揚州大學江蘇省作物栽培重點實驗室試驗棚內。使用盆栽方式種植，每盆播種20粒種子，在三葉期疏苗，每盆保留8棵。在小麥開花季節，采用植株掛牌記號筆標花的方法，準確記錄穗中部小穗基部小花的開花日期。

1.2 低溫處理

在小麥開花后6 d，進行人工低溫處理。試驗在人工氣候箱內進行，氣候箱內濕度75%，低溫處理組溫度為白天10 ℃(08:00-18:00)，光照20 000 lx，夜間4 ℃(18:00-08:00)；對照常溫處理組溫度為白天20 ℃(08:00-18:00)，光照 20 000 lx，夜間10 ℃(18:00-08:00)。低溫處理連續進行3 d，直到開花后8 d低溫處理結束。低溫結束后將小麥盆栽搬回試驗大棚進程常規水肥管理。

1.3 組織化學染色

取花后16 d、24 d和32 d的小麥穎果，用潔凈的剃須刀片將穎果中部縱切，置于體視顯微鏡下觀察并拍照，將縱切后的小麥穎果放入配置好的0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)染液中，黑暗條件下37 ℃染色30 min，置于體式顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 顯微結構觀察

取開花后16 d、24 d和32 d的小麥穎果，將穎果中部橫切，再縱向切取穎果片段，厚約 2 mm，迅速置于25 mg·-1的戊二醛中，4 ℃固定4 h，樣品經磷酸緩沖液(pH=7.2)清洗、乙醇梯度脫水、環氧丙烷置換、Spurr樹脂浸透與包埋后，在70 ℃恒溫干燥箱中聚合12 h，制成樹脂膠囊樣品。用超薄樹脂切片機切1 μm厚的薄片，然后用0.5%甲基紫染色10 min，在光學顯微鏡下觀察并拍照。每個樣品重復3次。

1.5 胚面積計算

使用圖像分析軟件Adobe Photoshop和Image-Pro Plus對拍攝的顯微圖像進行處理，將標尺設定后利用軟件中的面積分析工具測量麥胚的面積。

1.6 數據統計與分析

用Excel 2016統計試驗結果，用SPSS 19.0中LSD法進行顯著性檢驗，用Adobe Photoshop圖像處理軟件處理圖片。

2 結果與分析

2.1 低溫對小麥胚中脫氫酶活性的影響

TTC染色是TTC與活細胞線粒體內多種脫氫酶反應，生成紅色的三苯甲臜，可用來表示細胞的活力。從圖1可以看出，隨著花后天數的增加，胚尺寸逐漸變大。對于揚麥15而言，花后16 d，胚基本不被著色，常溫處理組與低溫處理組無明顯差異；花后24 d，常溫處理組小麥胚著色程度明顯高于低溫處理組；花后32 d，胚著色程度加深，且常溫處理組盾片染色程度比低溫處理組深。對于煙農19而言，花后16 d和32 d，常溫處理和低溫處理組胚著色程度均無明顯差異；花后24 d，常溫處理組胚著色程度高于低溫處理組。與揚麥15相比，花后16 d和24 d，煙農19胚的著色程度較高，說明煙農19胚的發育進程快，同一發育時期胚內脫氫酶活性強。以上結果表明，低溫處理會導致小麥胚脫氫酶活性降低，在花后24 d表現最為明顯。

NTT：常溫處理；LTT：低溫處理。下同。每個方框中左圖為未染色穎果縱切面，右圖為TTC染色穎果縱切面。

2.2 低溫對小麥胚分化的影響

從圖2可以看出，隨著發育天數的增加，常溫處理組小麥胚面積逐漸增大，結構逐漸分化，而低溫處理組小麥胚發育較緩慢，結構分化程度也慢于常溫處理組。花后16 d，揚麥15的常溫處理組與低溫處理組胚均未出現明顯分化；而煙農19的常溫處理組出現明顯的盾片和胚根原基分化，而低溫處理組盾片分化不明顯，說明揚麥15胚的發育進程比煙農19慢?；ê?4 d，揚麥15的常溫處理組胚分化出現明顯的盾片和胚根原基結構，胚尺寸整體大于低溫處理組；而煙農19的常溫處理組已出現明顯的胚芽分化，分化進程明顯快于低溫處理組?；ê?2 d，胚根原基進一步分化，可觀察到胚根鞘、胚根及根冠，胚芽結構明顯，可明顯觀察到胚芽鞘、第一葉原始體和莖生長點。總體而言，與揚麥15相比，煙農19胚發育進程和結構分化較快，而低溫處理延緩了這一進程。

圖2 常溫和低溫處理下小麥胚的顯微結構

利用Image-Pro Plus軟件對小麥胚進行面積計算，結果發現，在花后16 d、24 d和32 d，小麥胚面積逐漸增加，煙農19胚面積均顯著大于揚麥15(表1)。花后16 d，揚麥15的常溫處理組與低溫處理組均無顯著差異，煙農19的常溫處理組胚面積顯著大于低溫處理組。花后24 d和32 d，兩品種常溫處理組麥胚面積均顯著大于低溫組。

表1 低溫處理對小麥胚面積的影響

以上結果表明，低溫影響小麥胚面積的增長和結構的分化。低溫對不同小麥品種的影響程度不同，春性小麥受影響程度大于冬性小麥。

2.3 低溫處理后胚相關組織顯微結構的變化

2.3.1 盾片上皮細胞與薄壁細胞的變化

根據細胞形態的不同，盾片上皮細胞可分為頸部上皮細胞和底部上皮細胞兩個區域。從圖3可以看出，花后24 d，兩小麥品種常溫處理組盾片底部上皮細胞層數明顯多于頸部上皮細胞，而低溫處理組細胞層數變化不明顯，但底部上皮細胞略長于頸部上皮細胞；兩個小麥品種常溫處理組和低溫處理組薄壁細胞形狀均不規則，常溫處理組底部薄壁細胞貯藏物質均多于頸部薄壁細胞。揚麥15低溫處理組薄壁細胞貯藏物質少于同部位常溫處理組，而煙農19低溫處理組薄壁細胞貯藏物質多于同部位常溫處理組。花后32 d，兩小麥品種低溫處理組盾片上皮細胞尺寸明顯變大，層數增多，細胞排列緊密；薄壁細胞體積增大，貯藏物質增多。低溫處理組盾片上皮細胞層數、形態、薄壁細胞貯藏物質的積累變化與花后24 d規律類似。

A：頸部上皮細胞；B：頸部薄壁細胞；C：底部上皮細胞；D：底部薄壁細胞。

總體而言，揚麥15盾片上皮細胞層數少于煙農19，薄壁細胞面積也小于煙農19。以上結果表明，低溫處理影響盾片細胞發育，抑制上皮細胞的伸長和盾片底部上皮細胞層數的增多，同時使得薄壁細胞貯藏物質增多。

2.3.2 胚芽、胚軸和胚根的變化

從圖4可以看出，花后24 d，兩個小麥品種胚芽細胞常溫處理組和低溫處理組均未出現明顯分化，細胞核明顯，排列緊密，多為扁長形；常溫處理組胚軸薄壁細胞內積累的貯藏物質明顯多于低溫處理組，其中煙農19常溫處理組染色程度較淺；常溫處理組胚根細胞系列排列呈柵欄狀，而低溫處理組胚根細胞形狀不規則。花后32 d，兩個小麥品種常溫處理組的胚芽細胞分化出明顯莖生長點，細胞體積較大，形狀不規則，細胞核變大，而低溫處理組胚芽細胞體積和細胞核體積均明顯小于常溫處理組；兩個小麥品種常溫處理組胚軸薄壁細胞內積累的貯藏物質顆粒明顯多于低溫處理組，這和24 d的規律類似；兩個小麥品種常溫處理組和低溫處理組胚根細胞形態無明顯差別。以上結果表明，低溫對小麥胚芽、胚軸和胚根分化有影響，其中對胚軸薄壁細胞內貯藏物質的積累影響較大，低溫處理降低了貯藏物質的積累量。

2.3.3 輸導細胞的變化

從圖5可以看出，花后16 d，揚麥15常溫處理組和低溫處理組輸導細胞均開始出現輕微解體，大部分為空細胞；煙農19常溫處理組輸導細胞積累了少量淀粉體，而低溫處理組輸導細胞未積累淀粉體，這說明煙農19在常溫處理下胚乳表層的輸導細胞發育較快，淀粉積累較早。花后24 d，兩個小麥品種常溫處理組和低溫處理組輸導細胞均明顯解體，出現折疊層，煙農19的輸導細胞附近胚乳細胞淀粉體相對較多，而揚麥15幾乎沒有淀粉體積累，且常溫處理組輸導細胞解體比低溫處理組明顯，細胞折疊層數較多?；ê?2 d，輸導細胞基本全部解體，部分或全部折疊，折疊層數遠多于24 d。煙農19輸導細胞的解體及折疊過程均早于揚麥15。以上結果表明，在花后24 d，低溫處理對輸導細胞的影響較為明顯，減慢了輸導細胞的解體進程。

圖5 低溫處理對小麥穎果輸導細胞顯微結構的影響

3 討 論

本研究發現，花后低溫導致小麥胚結構分化延遲，體積增長減慢。不同小麥品種胚發育進程對低溫的響應程度不同，春性小麥所受影響大于半冬性小麥。

Pomeroy等[12]將冬小麥初生葉片的細胞分離，并暴露于低溫脅迫下，發現低溫狀態下細胞懸浮液中分離細胞的活力急劇下降。這與本試驗結果類似，本試驗中小麥胚細胞在低溫處理下細胞脫氫酶活性下降，這說明低溫導致小麥胚細胞新陳代謝水平降低。徐 瀾等[13]以10種冬小麥品種為材料，發現在低溫脅迫下，耐寒小麥品種的籽粒產量明顯高于其他品種。高志強等[14]研究發現，在小麥生長發育過程中，要求較長低溫春化時間的品種，抗寒性不一定強；但抗寒性強的品種，要求的春化時間一般較長，且低溫春化特性與抗寒性是品種的兩種特性，低溫春化有利于小麥抗寒性的形成。高立偉[15]研究發現，半冬性品種一般耐寒性較強，弱春性品種一般耐寒性較差，這與本研究的結論相一致。本研究中兩個小麥品種受花后低溫影響的程度不同，春性小麥胚面積的下降幅度高于半冬性小麥。低溫能夠延遲小麥胚的發育時期，影響胚面積的增長和結構的分化。楊 陽等[16]研究發現，在萌發過程中，小麥盾片上皮細胞由不規則形和多邊形向圓形轉變，細胞數目呈先減少后增加的趨勢，面積呈先增加后呈減小的趨勢；薄壁細胞內淀粉體不斷變形、塌陷并逐漸降解，蛋白體發生解體，而脂質體先降解后又重新合成。這些結果表明，小麥盾片具有吸收轉運養分、貯藏養分及保護胚等功能。本研究中低溫處理影響盾片細胞發育，抑制上皮細胞的伸長和盾片底部上皮細胞層數的增多，表明低溫影響盾片的發育，抑制盾片轉運養分，從而影響胚的發育，減慢胚的發育速度。

Tanida等[17]發現，在低溫條件下，水稻種子內部過氧化氫酶活性降低，胚的生長速率也明顯降低。劉逸童等[18]研究表明，在低溫條件下，不耐低溫儲藏的水稻種子胚部細胞排列較緊密，細胞間隙較小，細胞膜較完整。這說明低溫條件可以更好地維持胚的活力，使胚細胞分裂和分化的能力減弱。本研究也發現，低溫處理影響小麥盾片細胞發育，抑制上皮細胞的伸長，使得薄壁細胞貯藏物質增多。這也說明胚的各部分結構發育易受低溫的影響。

輸導細胞與胚發育密切相關，位于胚乳表層，向胚運輸養分[19]。本研究中，常溫處理組輸導細胞解體較多，且胚發育較快，這可能是由于輸導細胞解體后，養分被胚吸收，且常溫處理組輸導細胞解體進程較快，數目較多，胚吸收的養分也比低溫處理組多。而低溫處理減慢了輸導細胞的解體進程，使營養物質不能及時、足夠地運輸到胚，導致胚的發育緩慢。