快速液體培養法在結核分枝桿菌分離培養中的應用研究

李青，彭章麗，陳玲△，徐鵬，付雪峰

（1遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科結核病區，貴州 遵義；2遵義醫科大學生命科學研究院 貴州省普通高等學校傳染病與生物安全特色重點實驗室，貴州 遵義）

0 引言

結核病由結核分枝桿菌感染引起，是目前全球范圍內頭號傳染病殺手，也是全球范圍內導致死亡的十大疾病之一。抗酸染色法是臨床上最便捷快速的診斷方法[1]，但敏感度偏低，且無法區別結核分枝桿菌復合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）與 非 結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）。結核分枝桿菌分離培養是確診結核病最重要的依據，不僅能取得病原學結果，還能提供活的菌株和細菌組DNA，進行傳統藥敏檢測，指導臨床治療，可以進行全基因測序等獲取菌株的分子生物學信息[2,3]。目前改良羅氏固相培養法（lowenstein-jensen，L-J）是最流行的培養方法，也是結核病診斷的金標準，但該方法耗時長，給早期診斷和治療帶來巨大阻礙。快速液體培養是新的分枝桿菌培養方法，不但能較快地發現結核分枝桿菌[4]，并且具有良好的菌株回收率。為此，本研究對本實驗室隨機收集的120份標本進行快速液體培養法和改良固體羅氏培養法的對照研究，驗證快速液體培養法在結核病診斷中的準確性，評價它的優缺點。

1 資料與方法

1.1 標本來源

本院呼吸醫學研究室收集的疑似或確診結核病患者的痰標本101份，肺泡灌洗液9份，腦脊液2份，胸腔積液7份，腹腔積液1份，共計120份（標本收集符合遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會所指定的倫理學標準，并取得該委員會批準，受試者均簽署知情同意書）。其中男78例，女42例，年齡14-88歲，中位年齡56歲；其中76份痰標本分別進行抗酸染色（Ziehl—Neelsen，萋－尼法）鏡檢、改良羅氏（L-J）培養和快速液體培養法；44份標本進行Gene-Xpert MT/RIF、改良羅氏培養法和快速液體培養法。痰標本要求為黏液痰、膿痰、干酪痰或血痰，所有標本體積不少于2ml。

1.2 儀器及試劑

抗酸染色液、快速液體培養試劑由珠海貝索生物技術有限公司提供（抗酸染色液 貨號BA-4091；培養管 貨號BC9000；NALC法痰消化緩沖液 貨號BC1999；分枝桿菌液體培養添加劑 貨號BC9003）；改良羅氏培養基使用珠海市銀科醫學工程股份有限公司產品（貨號：1912131）；Gene-Xpert MTB/RIF樣本消化液及反應盒購于美國賽沛公司（貨號：1000166397）。相關儀器：離心機（長沙湘儀公司）；振蕩器（中國上海滬西分析儀器廠）；生物安全柜（美國Thermo公司）；顯微鏡（日本Olympμs公司）；分枝桿菌熒光檢測儀（珠海貝索生物技術有限公司）；Gene-Xpert MTB/RIF檢測儀器（美國賽沛公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰抗酸染色

萋－尼染色鏡檢：參照《結核病實驗室檢驗規程》抗酸桿菌顯微鏡檢查標準化操作程序及公司說明書進行萋－尼染色和顯微鏡鏡檢[5]。

1.3.2 Gene-Xpert MTB/RIF

參照試劑盒說明書，將標本 ( 痰、肺泡灌洗液、腦脊液、胸腔積液、腹腔積液) 與含氫氧化鈉及異丙醇的標本處理液按體積比1:2混合，震蕩混勻，室溫靜置15min，待標本完全液化后取2ml混合液轉移至反應盒中，置于Gene-Xpert檢測儀器進行全自動檢測,約2h即可在檢測軟件窗口直接讀取結果。

1.3.3 改良羅氏法[5]和快速液體培養法

試劑配制：標本處理/去污染試劑0.5gNALC加入100ml痰消化緩沖液；分枝桿菌液體培養添加劑培養液1瓶BASO營養劑復1瓶BASO 抑菌劑，每支BASO分枝桿菌液體培養管中加入0.8ml添加劑復溶物。

標本前處理及接種：①將痰抗酸染色或Gene-Xpert MTB/RIF檢測剩余的痰、肺泡灌洗液、腦脊液等直接轉移至 50ml離心管中，胸腹腔積液均全部離心后取沉淀轉移至50ml離心管中，視標本性狀加入1-2倍標本體積的新鮮配制的標本處理試劑，旋緊蓋子，振蕩30-60s，室溫靜置15 min。②加入1×PBS 緩沖液至45ml，上下顛倒混合均勻，3000×g離心20min后棄上清，加入1×PBS緩沖液1 ml混勻。③取500μl樣本接種到液體培養管中并旋緊蓋子上下顛倒混勻，取500μl接種到改良羅氏培養基中并使液體均勻分布于培養基中，37℃培養箱培養。

1.4 結果判讀

1.4.1 抗酸染色的結果判讀

藍色背景下抗酸桿菌呈紅色，外形細長或略彎曲及有分枝生長趨勢，結果判斷參照《結核病實驗室檢驗規程》。

1.4.2 Gene-Xpert MTB/RIF結果判讀

檢測軟件窗口直接讀取結果，包括MTB陽性，檢出高；MTB陽性，檢出中；MTB陽性，檢出低；MTB陽性，檢出極低；MTB陰性。

1.4.3 液體培養結果判讀

從培養的第2 d開始每24 h使用分枝桿菌熒光檢測儀進行檢測，熒光值≤12 為陰性，≥13 為陽性，報告陽性后繼續培養24 h，再檢測確認并進行萋－尼染色復檢（從培養管底部吸取部分標本進行涂片抗酸染色，證實為抗酸分枝桿菌后報告分枝桿菌培養陽性，此抗酸染色陰性并確認無脫片等情況后報告污染）；標本培養42 d分枝桿菌熒光檢測儀檢測仍提示為陰性結果時，報告分枝桿菌培養陰性。

1.4.4 改良固體羅氏培養法結果判讀

溫箱孵育接種后第3d、第7d分別觀察菌落的生長情況，以便發現污染情況和非典型性結核分枝桿菌的生長。以后每周觀察1次結果，若發現呈菜花狀表面粗糙的米黃色或白色菌落生長者，經抗酸染色證實為抗酸分枝桿菌，則報告分枝桿菌培養陽性;若培養60d后仍無菌落生長，則報告分枝桿菌培養陰性。

1.4.5 質量控制

本實驗操作人員均參加并通過中國疾病預防控制中心組織的結核病實驗室培養及藥敏測試和全國結核病分子診斷技術能力驗證等培訓及考試。

1.5 統計學處理

實驗數據采用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析，分別計算改良羅氏（L-J）培養和快速液體培養法的陽性率、污染率、培養時間，計算兩種培養方法與抗酸染色鏡檢或Gene-Xpert MTB結果的陽性符合率等；計量資料采用配對設計的t檢驗進行分析，計數資料采用配對設計的卡方檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種培養方法的陽性率比較

在所有120份標本中，改良羅氏（L-J）培養和快速液體培養法的陽性率分別為54.39%（62/114）和53.91%（62/115），差 異 無 統 計 學 意 義（χ2=0.0037，P=0.95），聯合培養的陽性率為70.83%（85/120），與單獨使用一種培養方法比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩種方法的污染率分別為5.00%（6/120）和4.17%（5/120），差異無統計學意義（χ2=0，P=1）。

76例（表1）進行痰抗酸染色、改良羅氏（L-J）培養和快速液體培養法的標本中，抗酸染色與兩種培養方法的陽性符合率分別為78.26%（36/46）和82.61%（38/46），差異無統計學意義（χ2=0.069，P=0.263）；兩種培養方法在抗酸染色陽性標本中的結果符合率為82.61%，在抗酸染色陰性標本中的結果符合率為66.67%，總結果符合率為76.32%。44例（表2）進 行Gene-Xpert MTB/RIF、改良羅氏（L-J）培養和快速液體培養法的標本中，Gene-Xpert MTB結果與兩種培養方法的陽性符合率分別為48.57%（17/35）和51.43%（18/35），差異無統計學意義（χ2=0，P=1），兩種培養方法在Gene-Xpert MTB陽性標本中的結果符合率為62.71%，在Gene-Xpert MTB陰性標本中的結果符合率為100%，總結果符合率為72.73%；改良羅氏（L-J）培養法和快速液體培養法在所有標本中的結果符合率為75.00%，在抗酸染色標本和Gene-Xpert MTB檢測標本之間的結果符合率差異無統計學意義（χ2=0.048，P=0.827）。

表1 抗酸染色標本的兩種培養方法比較（n）

表2 Gene-Xpert MTB標本的兩種培養方法比較（n）

2.2 兩種培養方法的培養時間比較

在所有120份標本中，改良羅氏（L-J）培養法的平均培養時間為（23.68±1.43）d，快速液體培養法的平均培養時間為（9.74±0.70）d，P＜0.0001，差異有統計學意義；在痰抗酸染色陽性標本中，兩種培養方法的平均培養時間 分 別 為（21.03±1.87）d和（8.13±0.42）d，P＜0.0001，差異有統計學意義；在Gene-Xpert MTB陽性標本中，兩種培養方法的平均培養時間分別為（29.88±2.93）d和（13.94±1.93）d，P＜0.0001，差異有統計學意義；由于痰抗酸染色陰性標本數量較少，故未做統計分析，兩種培養方法在Gene-Xpert MTB陰性標本中均未有陽性結果，故無法計算平均培養時間。

3 討論

結核分枝桿菌的改良羅氏（L-J）培養法是結核病診斷的金標準之一，但由于培養時間長、陽性率低等原因，不利于患者的及時治療以及傳染源的控制，在基層醫療機構中沒有普遍開展[6]。尋求比改良羅氏（L-J）培養法診斷效率更高或培養周期更短的結核菌培養方法一直是結核病診斷的研究熱點，此前文獻報道了MACTECTM MGITTM 960全自動分枝桿菌快速培養藥敏分析系統的陽性率和培養陽性周期均明顯優于改良羅氏（L-J）培養法[6,7]，但由于設備昂貴，無法在我國普及，尤其是在基層醫療單位和疾控中心。

本研究結果表明，快速液體培養法與改良羅氏（L-J）培養法相比，在陽性率、污染率之間差異無統計學意義；說明快速液體培養法擁有同改良羅氏（L-J）培養法一樣的靈敏度和特異度。此外，由于Gene-Xpert MTB的檢測靈敏度高于抗酸染色，而檢測靈敏度與細菌載量有關，所以兩種檢測陽性的標本中細菌載量可能不同，因此，分別對抗酸染色或Gene-Xpert MTB標本都進行兩種培養方法培養，對結果進行分層分析發現，痰抗酸染色或Gene-Xpert MTB與兩種培養方法的陽性符合率之間的差異也無統計學意義，兩種培養方法在所有抗酸染色或Gene-Xpert MTB標本中的結果符合率之間的差異同樣無統計學意義；但抗酸染色陽性標本的結果符合率高于Gene-Xpert MTB陽性標本，這證明了我們的猜想，無論是固體培養還是液體培養，培養陽性率都可能與標本中細菌載量有關。

我們還發現聯合培養的陽性率達70.83%，與單獨使用其中一種培養方法的陽性率相比均明顯提高了陽性率，差異均具有統計學意義，高于此前Somosk?vi A 等所報道的結果，且我們的研究未出現兩種培養方法同時污染的標本，有效降低了污染率，這說明聯合兩種方法進行培養既可以提高陽性率，也能有效降低污染率，提高了菌株回收率，能為進一步的藥敏試驗或全基因組測序等提供更多的標本，有利于患者的診斷和治療。

與改良羅氏（L-J）培養法相比，快速液體培養法無論是在所有標本中，還是在抗酸染色陽性或Gene-Xpert MTB陽性標本中都大大縮短了培養時間（平均縮短2周左右），差異有統計學意義，這為臨床及早診斷、制訂個性化治療方案提供了更加及時、準確的臨床依據，該結果與此前報道的多數相關研究相似。除培養陽性率與標本中細菌載量有關外，培養陽性結果檢出時間也與之相關。

病原學檢測是結核病診斷的金標準，抗酸染色法是臨床上最便捷快速的診斷方法，但敏感度低且無法區別MTB與NTM；GeneXpert MTB/RIF和環介導等溫擴增法均為分子檢測手段，檢測時間短，能較快地進行分枝桿菌核酸檢測[8-10]，GeneXpert MTB/RIF還能獲得利福平耐藥信息，但這兩種方法不能獲得MTB菌株，也不能進一步進行其他抗結核藥物的耐藥性檢測及全基因測序等深度分析；分枝桿菌培養的優點是可以獲得患者不同時期的菌株并可以進行大多數抗結核藥物的耐藥性檢測及進行全基因組測序[2,3]，可以對菌株的進化及疾病的發生發展傳播等提供有力依據，并且有文獻報道，分枝桿菌培養技術在痰和肺泡灌洗液中的陽性檢出率高于痰抗酸染色和GeneXpert MTB/RIF[11]，但分枝桿菌培養的缺點也很明顯，就是檢測時間長，尤其是改良羅氏（L-J）培養，培養時間長達4-8周，嚴重影響了患者當前的診斷和治療。因此，探索既能保留分枝桿菌培養的優點，又能實現快速檢測的方法是當前結核病診斷技術開發的重要研究方向。

本實驗采用的快速液體培養法是我國自主研發的手工熒光讀數儀，操作簡單，方便易行，目前已在國內多個省份的基層醫院和疾控中心中推廣，因此，快速液體培養法是一種比較理想的分枝桿菌快速培養方法，設備簡單、操作便捷，與改良羅氏（L-J）培養相比同樣具有敏感度高、特異性強、符合率高的特點[12]。是一種快速、經濟、實用、有效的檢測方法，適合在基層結核病防治結構推廣應用。