規(guī)?；膛?chǎng)犢牛腹瀉產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定

秦玉明,李偉杰,許冠龍,沈青春,杜吉革,謝士杰,孫石靜,丁家波,范學(xué)政,董 浩

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 大興 102600)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,C.perfringens)是一種革蘭氏陽性條件致病菌，廣泛存在于人和動(dòng)物的各種自然環(huán)境以及胃腸道中[1]。這種細(xì)菌與多種人類和動(dòng)物的系統(tǒng)性和腸道疾病有關(guān)。在人體內(nèi)，產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起氣性壞疽[2]、食物中毒[3]、胃腸紊亂[4]、肝和腎損害等疾病[5-6]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可導(dǎo)致2周內(nèi)新生兒患敗血癥而死亡[7]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是動(dòng)物壞疽性皮炎[8]、腸毒血癥[9]和壞死性腸炎的主要病原體[10-11]。同時(shí)該菌也是牛乳房炎的主要病原之一，會(huì)導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降、過早淘汰奶牛等，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。在我國(guó)20世紀(jì)80年代就有犢牛發(fā)生產(chǎn)氣莢膜梭菌病的報(bào)道[13-14]。自20世紀(jì)90年代以來，產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腹瀉病日趨嚴(yán)重，發(fā)病地區(qū)也不斷擴(kuò)大。目前已廣泛分布于全國(guó)各地，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展[15]。產(chǎn)氣莢膜梭菌作為一種可引起多種疾病的人獸共患病病原體，近年來在全球受到越來越多的關(guān)注[16]。

2019年10月，某規(guī)?；膛?chǎng)1頭3月齡犢牛出現(xiàn)腹瀉、拉血便等癥狀，引起駐場(chǎng)獸醫(yī)重視。本試驗(yàn)采集腹瀉犢牛和同群犢牛血清及肛門拭子樣品、大罐奶樣品，進(jìn)行常見腹瀉病原檢測(cè)、細(xì)菌分離鑒定、毒力因子多重PCR分型等，最終確診造成該牛場(chǎng)發(fā)病的病原為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。并用多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)技術(shù)對(duì)分離株進(jìn)行了菌群結(jié)構(gòu)分析。本研究可為規(guī)模化奶牛場(chǎng)預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的犢牛腹瀉提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采集腹瀉犢牛和同群犢牛血清及肛門拭子樣品各15份。大罐奶樣品100 mL，迅速放入含冰袋的泡沫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要試劑 犢牛腹瀉五聯(lián)檢測(cè)試紙條[輪狀病毒+冠狀病毒+大腸桿菌F5(K99)+隱孢子蟲、產(chǎn)氣莢膜梭菌，貨號(hào)：BioK396]，購自青島瑞爾生物技術(shù)有限公司；牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗原檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：99-43830)，購自IDEXX公司；產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基(貨號(hào)：PF652)，購自上海欣中生物工程有限公司；5%馬血清TSA培養(yǎng)板(每升含硫酸卡那霉素12.0 mg，多黏菌素B 3 mg)，實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 毒力基因多重PCR和MLST引物 序列均參考文獻(xiàn)[17-18]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用TE緩沖液稀釋備用。

1.4 對(duì)照菌 A型(CVCC37)、B型(CVCC53)、C型(CVCC57)、D型(CVCC82)和E型(CVCC90)，均來自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。同時(shí)從GenBank中下載部分序列用于比較分析(表1)。

表1 參考菌株來源Table 1 Origin of reference strains

1.5 方法

1.5.1 病原檢測(cè) 應(yīng)用犢牛腹瀉五聯(lián)檢測(cè)試紙條對(duì)15份肛門拭子和大罐奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，用BVDV抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)15份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，均按照各自說明書進(jìn)行操作。

1.5.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離培養(yǎng) 將15份肛門拭子樣品各用1 mL生理鹽水混懸，取150 μL混懸液涂布于產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基平板，倒放于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；48 h后各取1個(gè)典型桔紅色菌落于產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基平板上劃線，倒放于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取典型桔紅色菌落涂布于5%馬血清TSA培養(yǎng)板，倒放于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；次日用無菌生理鹽水洗脫，80 ℃滅活1 h后12 000 r/min離心2 min，取上清于-40 ℃凍存?zhèn)溆?。?00 mL大罐奶分裝至50 mL離心管，8 000 r/min離心15 min，棄乳液，取沉淀涂布于產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基平板，按肛門拭子樣品的處理方法培養(yǎng)和克隆。

1.5.3 毒力基因多重PCR分型鑒定 取克隆純化后的菌落滅活，取上清及對(duì)照菌DNA，按文獻(xiàn)[17]進(jìn)行分型PCR。

1.5.4 MLST分析菌群結(jié)構(gòu) 3個(gè)陽性樣品各取1個(gè) 典型克隆滅活，取上清及對(duì)照菌DNA按文獻(xiàn)[18]進(jìn)行MLST PCR。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將雙向測(cè)序獲得的8個(gè)看家基因序列，由DNASTAR 8.0 軟件拼接組裝，并在拼接時(shí)進(jìn)行校正，所有基因均與NCBI下載的12條參考序列進(jìn)行比對(duì)，并修整為相等的長(zhǎng)度。之后，將所有檢測(cè)基因序列(FASTA格式)導(dǎo)入Bionumerics軟件(Applied Maths Inc.,Austin,TX)進(jìn)行MLST分析。

2 結(jié)果

2.1 病原檢測(cè) 對(duì)15份肛門拭子和大罐奶樣品用犢牛腹瀉五聯(lián)檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有樣品均未檢出輪狀病毒、冠狀病毒、大腸桿菌F5(K99)、隱孢子蟲，而只有腹瀉犢牛產(chǎn)氣莢膜梭菌呈弱陽性；對(duì)15份血清樣品用BVDV抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性。說明產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起此次犢牛腹瀉的主要病原。

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng) 經(jīng)產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)和克隆，腹瀉犢牛及同群犢牛共3份肛門拭子樣品培養(yǎng)物產(chǎn)生典型的桔紅色產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落(陽性率為3/15=20.0%)。而大罐奶未分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌。說明大罐奶中產(chǎn)氣莢膜梭菌污染風(fēng)險(xiǎn)較低，帶菌量少，成年泌乳奶?；疾★L(fēng)險(xiǎn)不大。

2.3 毒力基因分型PCR鑒定 取3份陽性樣品的典型菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)。經(jīng)毒力基因分型PCR鑒定，3個(gè)樣品的克隆菌均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(圖1)。說明A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是導(dǎo)致該牛場(chǎng)犢牛腹瀉的主要毒素型。

圖1 克隆菌毒力因子多重PCR鑒定Fig.1 Clones identification of virulent gene by multiplex PCR1～5：A、B、C、D、E型對(duì)照；SX1～SX3:克隆株;M：DL2 000 marker(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)1-5：Control of A,B,C,D,E genotype;SX1-SX3:Clone strains;M：DL2 000 marker(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)

2.4 MLST分析菌群結(jié)構(gòu) 將3個(gè)陽性克隆菌、5個(gè)對(duì)照菌及來自NCBI的12個(gè)菌株的8 個(gè)等位基因序列用Bionumerics 軟件進(jìn)行MLST分析(圖2)。結(jié)果表明，3個(gè)克隆并不在同一分支。SX1克隆(來自腹瀉牛)與ATCC13124、Del1、CVCC37、JXJA17株在同一分支，而這個(gè)分支數(shù)量最多(5株)，且均為氣性壞疽或壞死性腸炎的致病株，而SX2(來自健康牛)與EHENE18、Str13在同一分支，SX3(來自健康牛)、LLYN11、JP838、CBA7123均自成一支。表明該牛場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜基因型較為復(fù)雜。

圖2 不同菌株MLST分析Fig.2 MLST clustering analysis of different strains

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是典型的條件性致病菌，在健康牛的腸道和畜舍環(huán)境中均普遍存在，通常情況下并不致病。但它可通過污染的土壤、水、灰塵、飼料、墊草、器具等傳播。當(dāng)飼料、氣候等條件發(fā)生急劇改變時(shí)，由于牛的抵抗力下降，在應(yīng)激條件下，牛腸道內(nèi)的正常菌群失調(diào)，微生態(tài)平衡被打破，原有的產(chǎn)氣莢膜梭菌就會(huì)大量生長(zhǎng)繁殖，瞬間產(chǎn)生大量的毒素會(huì)進(jìn)入犢牛血液循環(huán)，發(fā)生毒血癥(或敗血癥)，引起對(duì)心臟、肝臟、腎臟和腦等重要器官的毒害，導(dǎo)致機(jī)體衰竭、死亡。

產(chǎn)氣莢膜梭菌目前分為A、B、C、D、E共5個(gè)毒力型[1]，各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均能引起牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病，尤以A、C、D型居多。國(guó)外報(bào)道的產(chǎn)氣莢膜梭菌病以C、D型菌導(dǎo)致牛的壞死性腸炎或腸源性毒血癥較多；我國(guó)產(chǎn)氣莢膜梭菌則以A型菌為主，也時(shí)有C和D型菌致病的報(bào)道。

本次發(fā)病的牛場(chǎng)經(jīng)犢牛腹瀉五聯(lián)檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，只有腹瀉犢牛肛門拭子檢測(cè)呈弱陽性結(jié)果，而其他健康牛均未檢出，而分離培養(yǎng)時(shí)，腹瀉牛和2頭健康牛分離到了產(chǎn)氣莢膜梭菌，說明健康牛糞便中帶菌量較低。根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)，引起犢牛發(fā)病與帶菌量有一定關(guān)系。對(duì)3株分離菌進(jìn)行毒素基因多重PCR鑒定均為A型菌。進(jìn)一步對(duì)3株分離菌進(jìn)行MLST菌群分析，結(jié)果卻不在同一分支。這一結(jié)果說明牛場(chǎng)中產(chǎn)氣莢膜梭菌基因型存在多態(tài)性。因產(chǎn)氣莢膜梭菌并不作為引種時(shí)的檢疫項(xiàng)目，這一現(xiàn)象需引起更多的關(guān)注。

因產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起人的食源性疾病，本試驗(yàn)同步檢測(cè)了該場(chǎng)大罐奶，但未分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌，說明大罐奶中產(chǎn)氣莢膜梭菌污染風(fēng)險(xiǎn)較低。盡管如此，仍然不能忽視產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)乳制品的污染風(fēng)險(xiǎn)。

目前牛的產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要靠藥物治療，還沒有專門用于牛的產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗，因此采取綜合預(yù)防措施非常重要。一方面提高動(dòng)物的抵抗力和改善飼養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)還要加強(qiáng)采奶環(huán)節(jié)的衛(wèi)生管理、屠宰場(chǎng)的衛(wèi)生管理，盡可能降低終產(chǎn)品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染風(fēng)險(xiǎn)。

致謝：本文MLST分析由Bionumetrics金云臺(tái)公司崔箐坡博士協(xié)助完成。