氣相色譜質譜法測定土壤中5種苯并咪唑類的殘留

郭延萍，劉永玲

(海東市生態環境局，青海 海東 810600)

0 引 言

苯并咪唑類殺菌劑，是指含有殺菌活性的咪唑環類的有機化合物，如噻菌靈、咪鮮胺等，在農業、林業等廣泛應用，確保農作物、林作物等高產、穩定[1-3]。該類殺菌劑屬于內吸性殺菌劑，通過與病原真菌的微管蛋白結合，抑制病菌細胞的有絲分裂，起到殺菌、抑菌的作用[4]。苯并咪唑類殺菌劑常用于水稻類紋枯病、稻瘟病，小麥類黑穗病、赤霉病，瓜果類白粉病、灰霉病等，該類殺菌劑毒性低，且能夠抑制病菌生長，在殺菌劑市場占據著關鍵的地位，隨著對具有抗菌活性的咪唑類殺菌劑和分子生物學的研究，該類殺菌劑的應用也越來越廣[5]。據統計，殺菌劑在噴灑、施用時，約20%起到殺菌、抑菌作用，大部分的殺菌劑隨著空氣流通、雨水沖刷等進入到土壤中，對土壤環境造成不可逆的損傷，嚴重影響土壤微生物、動物等生態系統[6]。因此，加強對典型土壤中苯并咪唑類殺菌劑殘留的監測，具有重要的意義。

常用于土壤前處理的提取方法主要有：固液萃取提取法、超聲提取法和加速溶劑提取法等；凈化的主要方法有：凝膠凈化色譜法、QuEChERS (Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)凈化法和固相萃取凈化法等方法[7-9]。提取方法中，加速溶劑萃取是在高溫、高壓條件下進行多次提取，提取效率相對最佳；凈化方法中，QuEChERS 凈化法相對其他方法，具有試劑用量少，凈化效果好、操作簡便等優點，實驗開發一種采用加速溶劑提取法將典型土壤中噻菌靈、惡咪唑、抑霉唑、咪鮮胺和氟菌唑提取出來，QuEChERS 凈化法將提取液凈化后，上GCMS/MS 儀定量測定的分析方法[10-15]。實驗證明，此方法檢測準確度高、靈敏度高，可以用于典型土壤中苯并咪唑類殺菌劑殘留的監測。

1 試驗部分

1.1 儀器

氣相色譜儀：Agilent 7890B 型，配備自動進樣器、柱溫箱（美國安捷倫公司）；三重四級桿串聯質譜儀：Agilent 7000D 型（美國安捷倫公司）；電子分析天平：sartorius Quintix65-1CN 型（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；加速溶劑萃取儀：Thermo ASE-300 型（美國熱電公司）；高速冷凍離心機：Biobase TGL-20M 型（山東博科公司）；純水制備儀：Milli-Q direct 16 型(美國密理博公司)。

1.2 標準物質和試劑

噻菌靈標準溶液：100μg/mL，編號為GBW(E) 082320;抑霉唑標準溶液：100μg/mL，編號為GBW(E) 082421;咪鮮胺標準溶液：100μg/mL，編號為GBW(E) 082347;氟菌唑標準溶液：100 μg/mL，編號為BWQ 8059—2016；惡咪唑標準物質：100 mg/瓶，編號為C15789000，以上均購自農業農村部環境保護科研監測所。乙腈、丙酮、正己烷、甲醇：色譜純（上海安譜科技有限公司）；實驗用水均為去離子水，純水制備儀制備，其他試劑均為分析純（上海化學試劑廠）。

1.3 儀器方法

1.3.1 色譜條件

氣化室溫度：240 ℃；色譜柱：HP-5 MS（規格：30 m×0.25 mm，0.25 μm）載氣：氦氣，純度99.9999%；柱流量：1.15 mL/min；進樣方式：不分流；進樣量：1 μL，梯度升溫。升溫程序見表1。

表1 程序升溫方法

1.3.2 質譜條件

離子源：ESI 源；電子轟擊電壓：65 eV；離子源溫度：270 ℃；碰撞氣：氬氣，純度99.9999%；接口溫度：260 ℃；采集模式：MRM；溶劑延遲：3.6 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準儲備溶液的配制

取惡咪唑標準物質，精密稱取50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻；再精密移取100 μL 該溶液，置10 mL 量瓶中，另取噻菌靈、抑霉唑、咪鮮胺和氟菌唑標準溶液，分別精密移取1.0 mL，置上述10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻（5種殺菌劑濃度均為：10 μg/mL）。

1.4.2 標準溶液的配制

取1.4.1 標準儲備溶液，定量移取適量，分別置10 mL 量瓶中，制備含5種殺菌劑濃度依次為0.05，0.15，0.6，2.0，6.0，15.0 μg/mL 的標準系列溶液，加甲醇定容至刻度，混勻。

1.4.3 樣品溶液的制備

前處理：取研細后的典型土壤樣品，過60 目篩網，取過篩后的土壤樣品12 g，加15 g 硅藻土，混合均勻后裝填至22 mL 的萃取罐中，用乙腈-丙酮（體積比為1∶1）混合溶劑萃取。萃取方法見表2。

表2 萃取條件

凈化：將上述萃取液轉移至旋蒸瓶中，45 ℃旋蒸至近干，用20 mL 冰醋酸（1%）-乙腈溶液轉移至50 mL 塑料離心管中，加入分散固相萃取劑硫酸鎂5 g、乙酸鈉2 g 鹽析，渦旋1 min，高速冷凍離心6 min（轉速為10000 r/min）；將離心后的上清液轉移至25 mL 裝有凈化試劑PSA 的凈化管中，渦旋1 min，高速冷凍離心6 min（轉速為10000 r/min）。將離心后的凈化液置試管中，氮吹至近干（溫度45 ℃），殘渣加甲醇1 mL，混勻即得。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

土壤基質通常含有大量的無機物、有機物、水分等，如金屬氧化物、硅酸鹽等，成分較為復雜，常用的前處理方法有：超聲提取法、索氏提取法和加速溶劑提取法等。高效的前處理方法，須將待測物盡量進行提取，且將干擾物質進行消除。超聲提取法和索氏提取法，待測物提取率偏低、基質干擾較大，最終導致檢測結果準確度偏低等；加速溶劑提取法是在一定的溫度和壓力下，反復多次的提取，待測物提取率高，且通過研究合適的提取溶劑，可以有效降低基質干擾。實驗通過考察對加標濃度為0.15 μg/mL 的加標樣品進行提取后提取率，比較上述3種方法對5種咪唑類殺菌劑提取率的影響，最終確定快速溶劑萃取法作為前處理方法。比較結果見表3。

表3 前處理方法比較結果

2.2 萃取條件的優化

加速溶劑萃取法，是在高溫、高壓的條件下將待測殺菌劑，從土壤基質中提取出來的前處理方法，影響其提取效果的因素主要是溫度和壓力。選擇適合的溫度能夠保證提取溶劑在樣品基質中加速流動，降低待測殺菌劑與土壤的相互作用力；同樣選擇合適的壓力，能夠保障萃取溶劑保持液態，更快地與土壤基質混合，從而提高待測殺菌劑在萃取過程的溶解能力，達到高效提取的目的。實驗通過設定萃取溫度（80，85，90，95，100 ℃）和萃取壓力（9，9.5，10，10.5，11 MPa），考察典型土壤加標樣品（加標濃度：0.15 μg/mL），在上述變化條件下的提取情況。結果，選擇萃取壓力為10 MPa 和95 ℃時，回收率達到最佳。

2.3 色譜柱的優化

實驗考察氣相色譜-質譜法常用的HP-5 MS、DB-17 MS 和Rtx-5 MS 型質譜專用柱，柱長度、膜厚和內徑均一致。保持1.3 儀器方法項下色譜和質譜條件，考察上述3種不同極性色譜柱對5種待測殺菌劑分離情況和重復性的影響。結果，選擇DB-17 MS 和Rtx-5 MS 型色譜柱時，5種待測殺菌劑分離效果差，且重復性實驗結果較差；選擇HP-5 MS色譜柱時，5種待測殺菌劑響應和分離良好，峰型尖銳，重復性結果良好。故實驗選擇HP-5 MS 色譜柱作為分離柱。

2.4 MRM 方法的優化

取5 μg/mL 的噻菌靈、惡咪唑、抑霉唑、咪鮮胺和氟菌唑標準溶液，按照1.3 項下的質譜條件進行一級掃描-全掃描（Q3Scan 模式），確定各農藥的目標離子和保留時間。然后對目標離子進行二級掃描-產物離子掃描（Production scan 模式），得到母離子對應的碎片離子。特征離子對以及相應的碰撞能量、豐度比是質譜測試的定性依據。而定量計算時，為保證檢測結果的準確度，通常以豐度較大的特征離子對的色譜峰面積作為定量依據。因此，本文選擇響應較高的一個碎片離子作為定量離子，再選擇2個碎片離子作為定性離子。對此方法進行碰撞電壓、碰撞時間等的優化，最終確定5種農藥殘留的多反應監測（MRM）方法。5種農藥典型色譜圖見圖1，質譜離子參數見表4。

圖1 5種農藥質量色譜圖

表4 5種農藥質譜參數1)

2.5 方法線性范圍、曲線方程和檢出限

取1.4.1 標準儲備溶液，定量移取適量，分別置10 mL 量瓶中，制備含5種殺菌劑濃度依次為0.05，0.15，0.6，2.0，6.0，15.0 μg/mL 的標準系列溶液，加甲醇定容至刻度，混勻；按1.3 儀器方法項下色譜和質譜條件，分別進樣以上溶液各1 μL，收集譜圖。根據譜圖中待測殺菌劑響應值為縱坐標（Y），對應的濃度為橫坐標（X），計算標準曲線方程，以3 倍信號噪音比值計算檢測限，結果如表5 所示。

表5 待測殺菌劑線性范圍、曲線方程、相關系數和檢出限

2.6 加標回收率考察

取空白典型土壤樣品，過60 目篩網，取過篩后的土壤樣品12 g，加15 g 硅藻土，混合均勻后裝填至22 mL 的萃取罐中，分別加入1.4.1 標準儲備溶液適量，后續按1.4.3 樣品溶液項下方法處理，制備含5種待測殺菌劑濃度分別為0.02，0.15，2.0 μg/mL的加標溶液，每個加標濃度點配制3 份；再按1.3 儀器方法項下色譜和質譜條件，分別進樣以上溶液各1 μL，收集譜圖，根據實際檢測結果和加入量計算加標回收率，結果見表6。

表6 加標回收率結果

2.7 方法重復性試驗

取空白典型土壤樣品，過60 目篩網，取過篩后的土壤樣品12 g，加15 g 硅藻土，混合均勻后裝填至22 mL 的萃取罐中，加入1.4.1 標準儲備溶液適量，后續按1.4.3 樣品溶液項下方法處理，制備含5種待測殺菌劑濃度為0.06 μg/mL 的加標溶液，同法平行制備6 份；再按1.3 儀器方法項下色譜和質譜條件，分別進樣以上溶液各1 μL，收集譜圖，計算6次檢測結果的重復性RSD。結果，噻菌靈、惡咪唑、抑霉唑、咪鮮胺和氟菌唑重復性RSD 分別為3.26%、3.18%、3.75%、4.43%和2.73%，表明方法具有良好的重復性。重復性試驗結果見表7。

表7 重復性試驗結果

3 結束語

實驗建立采用加速溶劑提取法將典型土壤中噻菌靈、惡咪唑、抑霉唑、咪鮮胺和氟菌唑提取出來，QuEChERS 凈化法將提取液凈化后，上GC-MS/MS儀定量測定的分析方法。實驗首先對土壤的前處理方法進行了選擇，確定加速溶劑萃取法作為前處理方法；考察了常用萃取溶劑的萃取效果，對色譜條件和質譜條件進行了優化，確定上述最佳條件后，對方法的線性、重復性、加標回收率等進行了考察，結果表明實驗建立的方法線性范圍廣、加標回收率范圍在85.9%～103.1%之間，5種待測殺菌劑重復性（n=6）均在5.0%范圍內。實驗結果證明方法具有前處理速度快、靈敏度高、檢測結果準確等優點，可以用于典型土壤中苯并咪唑類殺菌劑殘留的監測。