豬源性大腸桿菌的分離鑒定及菌株耐藥性分析

孫偉，劉杉杉,2 *，張睦堅(jiān)，陸佳，楊再錦，王倩

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院貴州銅仁 554300；2.民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心貴州銅仁 554300）

大腸桿菌是分布最廣、分離率最高的革蘭氏陰性菌。通常在機(jī)體抵抗力下降的時(shí)候，大腸桿菌作為一類機(jī)會(huì)性致病菌，可引起腹瀉病（腸內(nèi)毒性大腸桿菌）、腸外感染（腸外致病性大腸桿菌）、全身感染、毒性（產(chǎn)腸毒素大腸桿菌）和嚴(yán)重的敗血綜合征，甚至導(dǎo)致人和動(dòng)物死亡，已成為全球關(guān)注的問題[1]。大腸桿菌血清學(xué)眾多，臨床上，通常采用抗菌藥對豬場中大腸桿菌引起的疾病進(jìn)行治療。然而，養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，抗生素不科學(xué)使用導(dǎo)致的耐藥菌株出現(xiàn)的問題還十分嚴(yán)重。這些耐藥菌種通過水源、食品等多種途徑，嚴(yán)重破壞豬群正常腸道菌群的平衡，對養(yǎng)豬業(yè)來說是一種隱患，同時(shí)也威脅著人類的健康。目前，我國已經(jīng)學(xué)者已經(jīng)在多個(gè)規(guī)模化豬場中分離到了多種耐藥菌種[2,3]，提示抗菌藥物濫用造成的后果嚴(yán)重。

針對抗菌藥物在銅仁市規(guī)模化養(yǎng)殖場耐藥情況的相關(guān)研究報(bào)道較為少見。因此，為了初步了解銅仁市養(yǎng)殖場大腸桿菌耐藥情況，本研究選取筆者服務(wù)的某豬場，分別采集成年豬和仔豬肛門拭子，從中分離大腸桿菌，并選取常見治療用藥物，進(jìn)行耐藥性分析，旨在為科學(xué)用藥提供一定的指導(dǎo)。

1 材料方法

1.1 主要試劑

無菌采樣管（HBPT034-2）、大腸桿菌成套檢測試劑（SHBG16）、伊紅美藍(lán)瓊脂平板（HBPM007）、革蘭氏染色液試劑盒（HB8278），LB 肉湯培養(yǎng)基均購自青島海博生物科技有限公司。頭孢噻吩、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、萘啶酸和氧氟沙星等藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。引物通過Ologo 7.0 軟件設(shè)計(jì)并送往上海生工合成。

1.2 樣品的采集與處理

在銅仁市某豬場通過采集仔豬和成年豬肛門拭子獲取樣品，并接種到無菌的肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌分離、純化

將擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌體，均勻涂布在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)12～16h。無菌操作，挑取金屬光澤的菌落，劃線后進(jìn)行純培養(yǎng)，挑取單菌落置于L 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌革蘭氏染色

按照說明書操作進(jìn)行革蘭氏染色。接種環(huán)取環(huán)菌液，置于干凈的載玻片上。經(jīng)自然干燥或是酒精固定后，滴加一滴結(jié)晶紫染液，約1min 后，清水沖洗，干燥后滴加碘液進(jìn)行媒染，，同樣經(jīng)水洗后，經(jīng)95%乙醇溶液脫色，滴加番紅染液進(jìn)行復(fù)染。水洗后，待玻片自然干燥后，于油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和著色情況。

1.5 大腸桿菌基因鑒定

參考文獻(xiàn)[4]，利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行目標(biāo)基因片段擴(kuò)增，引物具體信息見表1。

表1 引物序列

1.6 藥敏試驗(yàn)

取200μL 擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌液，均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基表層。待菌液完全吸收后，經(jīng)待檢藥敏片吸附在培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16h。根據(jù)歐盟藥品試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的瓊脂培養(yǎng)法，測量抑菌圈直徑大小，并參考?xì)W盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，以此來判定細(xì)菌對藥物的敏感性[5]。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌分離鑒定

采集的肛門拭子樣品，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)帶金屬光澤的菌落。經(jīng)革蘭氏染色，結(jié)果均為紅色的短桿菌。并經(jīng)PCR 擴(kuò)增出陽性菌落，對其基因進(jìn)行測序，結(jié)果表明成功分離到2 株豬源性大腸桿菌，分別命名為P1 和P2 樣品。

2.2 藥敏試驗(yàn)

通過測定抑菌圈直徑，并根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)，判斷P1 和P2 菌株對藥物的敏感度。結(jié)果表明，不同年齡豬只分離出來的大腸桿菌耐藥性具有一定的差異。P1 菌株對環(huán)丙沙星抑菌圈直徑為19mm，提示對該藥物高度敏感；而對氧氟沙星、頭孢噻吩中度敏感，抑菌圈直徑顯示分別為15mm 和11mm；對四環(huán)素、磺胺嘧啶、慶大霉素具有耐藥性，所測得的抑菌圈直徑均在10mm 以下。P2 菌株對抗菌藥物的敏感度則有很大差異，表現(xiàn)出對萘啶酸和氧氟沙星中度敏感，抑菌圈直徑分別為15mm 和13mm；而對四環(huán)素、環(huán)丙沙星和和氧氟沙星抑菌圈直徑均在8～9mm 之間，具有耐藥性。

3 討論

大腸桿菌是一種常見于哺乳動(dòng)物腸道的共生微生物，當(dāng)它攜帶有某些毒力基因或具有其他特性（如抗微生物基因）時(shí)，有可能會(huì)對人和動(dòng)物體具有致病性[6]。耐多藥大腸桿菌能引起多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。抗菌劑的應(yīng)用主要用于促進(jìn)生長、預(yù)防和治療疾病。科學(xué)界普遍公認(rèn)的觀點(diǎn)是，在動(dòng)物生產(chǎn)中使用抗菌劑是導(dǎo)致抗藥性細(xì)菌（如大腸桿菌、沙門氏菌等）逐漸增加的主要原因之一。豬肉占世界肉類供應(yīng)總量的36%[7]，中國又是世界上最大的豬肉消費(fèi)國。因此，耐藥菌株的增加關(guān)系到食品安全問題。

大腸桿菌具有沿著食物鏈轉(zhuǎn)移的潛力，且易于分離、易于獲得并穩(wěn)定遺傳等特性，可成為一種適合于研究耐藥特性候選菌種。本研究中發(fā)現(xiàn)，從健康的豬只體內(nèi)分離到的P1 菌株對四環(huán)素、磺胺嘧啶、慶大霉素具有較強(qiáng)的耐藥性，而P2 菌株則對四環(huán)素、環(huán)丙沙星和和氧氟沙星具耐藥性較強(qiáng)。這說明，銅仁市區(qū)內(nèi)豬場已經(jīng)有多重耐藥菌株的存在。因此，有必要做進(jìn)一步的調(diào)研研究，才能科學(xué)指導(dǎo)養(yǎng)殖場規(guī)范使用抗生素，減少對豬群甚至是人類食品安全的影響。