葡萄桑葚復合果醋工藝優化和不同發酵時期的風味成分檢測

石晨暉，沈曉溪，張一鳴，趙梓伊，李思怡，楊晉一，汪婷婷，尚宏麗

（錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧錦州 121001）

葡萄屬漿果類，皮薄且多汁，具有多種保健功能[1]。葡萄中酚類等活性成分含量較多，經研究表明，由非金屬元素砷引起的小鼠生殖毒性能從葡萄果皮提取物中的酚類物質得到緩解[2]；此外多酚類物質還有清除自由基、預防慢性疾病等功效[3]。桑葚屬聚合果類，呈深紫色，含有蘆丁、花色苷、白黎蘆醇等活性成分[4]以及水溶性維生素，是可作為中藥食用的果品之一[5]。桑葚不僅起到抗氧化[6]、降低膽固醇、延緩衰老等功能，還具有滋養及黑發明目等功效[7]。研究表明，桑葚提取物對非酒精性脂肪性肝病有良好的防治作用[8]，對青年人群的注意力、直覺、運動能力有增強作用[9]。

果醋是一種新型飲品和調味品，氨基酸和有機酸含量豐富，有抗氧化、抗菌、消除機體疲勞[10]及促進血液循環等[11]生物功能。其中葡萄果醋是常見的功能性飲品，含有大量有機酸且能增強人體的免疫功能，深受消費者喜愛。然而目前市場上果醋的原料太過單一，所以許多學者開始研究復合型果醋，例如，陳智理等[12]研究以香蕉、西番蓮及龍眼為原料的復合果醋，研究其固定化生產材料和生產工藝，最后確定玉米芯為固定化生產材料，并經優化得出復合果醋醋體的總酸度達到最大值5.05%。如今對于復合果醋的研究更注重于工藝的優化、成分的優化選擇以及風味的改良等方面[13?14]。對于不同食品的風味成分檢測，包括電子鼻、氣相色譜-質譜（GC-MS）、氣相色譜-吸聞（GC-O）等技術。其中電子鼻技術操作簡便、靈敏度高且檢測速度快，并對所檢測樣品的不同加工階段有效區分[15]，據曹有芳等[16]的研究表明，采用單因素實驗和電子鼻技術結合主成分分析，獲得電子舌的最佳檢測參數為樣品稀釋30倍，應用優化的參數進行電子鼻分析可有效區分陜長富、甘長富、魯長富三種蘋果酒，區分效果較好；蓬桂華等[17]比較了電子鼻和電子舌對市售不同品牌桑果汁氣味、滋味分析的差異，其主成分分析累計方差貢獻率達99.905%，各樣品判別指數在0.977~1.000之間，結果表明電子鼻能夠對不同樣品進行準確區分。

本研究摒棄傳統單一型原料果醋，以葡萄和桑葚為原料，以果醋產酸量為檢測指標，考察初始乙醇濃度、pH、醋酸菌接種量、發酵溫度指標對葡萄和桑葚復合型果醋品質的影響，旨在開發一款營養物質搭配平衡且全面的復合型果醋最佳工藝，豐富果醋原料種類，為復合型果醋發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄（巨峰）、桑葚（桑甜1號） 錦州市水果超市；釀酒酵母菌 安琪酵母股份有限公司；醋酸菌錦州醫科大學實驗室保存；白糖 錦州市大商集團；果膠酶（50000 U/g）、葡萄糖（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、碳酸鈣（CaCO3） 天津市致遠化學試劑有限公司；固體培養基（g/L）：酵母膏1%，葡萄糖1%，CaCO32%，無水乙醇3%，瓊脂2%，121 ℃滅菌21 min（CaCO3經165 ℃，30 min干熱滅菌）；液體培養基（g/L）：葡萄糖1%，酵母膏1%，120 ℃滅菌21 min，用前加3%無水乙醇（pH自然）。

HZQ-X500型恒溫立式振蕩培養箱 上海一恒有限公司；HH-S28型雙列八孔水浴鍋 常州梅香儀器有限公司；PEN3型電子鼻 北京盈盛恒泰科技有限公司；HN-25S型恒溫培養箱 山東博科生物產業有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺 廣州凱雷智能科技有限公司；PHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器有限公司；KEM/DA-100型酒精計 日本京都有限公司。

1.2 實驗方法

葡萄桑葚復合果醋工藝流程：原料清洗→攪拌、榨汁→酶解（果膠酶）[18]→過濾→調配（加白糖、檸檬酸）→酒精發酵→加入活化后的醋酸菌→醋酸發酵→過濾→殺菌（巴氏殺菌，68~70 ℃加熱30 min）→裝罐→成品果醋

1.2.1 原料處理 挑選成熟且無損傷的葡萄和桑葚，進行清洗，按照1:1的原料比稱量后放入攪拌機中進行攪拌、榨汁，向葡萄桑葚果汁液中加入質量分數0.15%的果膠酶，攪拌均勻并放入30 ℃加熱2 h，以分解原料中的果膠物質。酶解后的葡萄桑葚果汁液使用脫脂棉紗布擠壓過濾并裝瓶備用，然后根據1.7 g/L的糖能產生1%酒精加入適量白糖[19]，調節適宜發酵糖度，再加入檸檬酸將果汁pH調配至5.0。調配完成后，裝入已滅菌發酵罐中。

1.2.2 酒精發酵 稱取5 g的釀酒酵母置裝有100 mL葡萄糖溶液的燒杯中，放入37 ℃的恒溫水浴鍋中加熱10 min活化，不斷攪拌至溶液產生小氣泡為止。按7%的接種量將活化后的釀酒酵母接種于1 L發酵容器中并用4層脫脂紗布進行密封，放置于實驗室陰暗處，在28~30 ℃條件下進行酒精發酵。發酵5~6 d后取出，調整初始乙醇濃度。

1.2.3 醋酸菌活化 按照上文所述配制，滅菌后冷卻至室溫，并向固體、液體培養基中分別加入質量分數為3%的無水乙醇。取出斜面保藏的自篩醋酸菌，取一環用劃線分離法接種于冷卻后的固體培養基中30 ℃培養2d，再接種至裝有液體培養基的錐形瓶中，將接種后的液體培養基放置于立式搖床中在30 ℃，150 r/min條件下振蕩培養24 h，至濃度為2.4×109CFU/mL備用。

1.2.4 醋酸發酵 葡萄糖直接轉化為醋酸的含量低，因此需醋酸菌氧化經酒精發酵后產生的乙醇而生成足量醋酸。接種一定量的活化醋酸菌至發酵液中，并在一定溫度，150 r/min條件下振蕩發酵7 d。發酵期間每24 h測量一次產酸量[20]。

1.2.5 單因素實驗 根據上述發酵工藝，將初始乙醇濃度設置為5%、6%、7%、8%、9%，其余條件固定為：醋酸菌接種量8%，發酵溫度32 ℃，pH5.0，測定果醋發酵后的產酸量；發酵pH調節為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，其余條件固定為：初始乙醇濃度7%，接種量8%，溫度32 ℃，測定發果醋產酸量；將醋酸菌接種量設置為4%、6%、8%、10%、12%，其余條件固定為：乙醇濃度為7%，溫度32 ℃，pH5.0，測定果醋產酸量；將溫度分別設置為28、30、32、34、36 ℃，其余條件固定為：初始乙醇濃度7%，接種量8%，pH5.0，進行果醋產酸量測定。

1.2.6 響應面試驗 本文采用響應面試驗設計[21]分析和預測葡萄桑葚復合果醋最佳工藝條件。經1.2.5所述單因素實驗并結合多重比較，初步選取響應面試驗的主要因素條件：初始乙醇濃度（6%、7%、8%）、pH（4.5、5.0、5.5）、醋酸菌接種量（8%、10%、12%）、發酵溫度（30、32、34 ℃），產酸量為響應值。使用Design Expert 10軟件對已知實驗數據進行分析，試驗設計見表1 。

表1 響應面試驗設計水平與編碼Table 1 Response surface test design level and coding table

1.3 電子鼻檢測

本文采用PEN3型電子鼻對葡萄桑葚復合果醋不同發酵時期進行風味成分檢測[22]。PEN3型電子鼻設備，主要利用其具有的10個氣體傳感器[23]來進行樣品的風味成分測定，傳感器名稱和性能見表2。將不同發酵時期果醋準確量取相同質量20 mL裝入50 mL燒杯中，用封口膜密封，室內環境為23~28 ℃，3組樣品各3個平行。測定參數設為5 s樣品預備時間，1 s樣品分隔時間，10 s調零時間，100 s沖洗時間，60 s測定時間。

表2 PEN3型電子鼻的傳感器及性能Table 2 Sensor and performance of PEN3 electronic nose

1.4 數據處理

使用WPS Office Excel軟件進行實驗中的數據分析和圖表制作。使用PEN3型電子鼻配套的Win-Muster軟件對49~58 s的果醋揮發性成分測定數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 初始乙醇濃度對果醋發酵的影響

如圖1所示，固定其他發酵因素的情況下，隨著初始乙醇濃度的增加，產酸量呈先增加后減少的趨勢，初始乙醇濃度對果醋發酵影響顯著（P<0.05）。在初始乙醇濃度小于7%時，產酸量隨濃度升高而增加；超過7%產酸量開始下降但仍高于乙醇濃度為5%和6%，可能是在乙醇濃度低時，沒有構成滿足醋酸菌生長的條件，而乙醇濃度增高時，醋酸菌活性又被抑制[24]，從而產酸量呈先上升后下降的趨勢。并且經多重比較分析，初始乙醇濃度為7%時產酸能力較強，對果醋發酵的影響相比其它濃度最為明顯。因此，初始酒精濃度為7%是最優條件，并將其作為響應值，6%、7%、8%三個初始乙醇濃度為響應面試驗中的三個水平。

圖1 初始乙醇濃度對醋酸發酵的影響Fig.1 Effect of initial ethanol concentration on acetic acid fermentation

2.2 發酵pH對果醋發酵的影響

如圖2所示，不同發酵pH對果醋發酵影響顯著（P<0.05），產酸量在pH為5.0時達到峰值，小于5.0時隨pH增加而增加，大于5.0時逐漸減少。原因可能是pH為4.0、4.5和5.5、6.0沒有為醋酸發酵創造良好的條件，抑制了醋酸菌體中的酶活性，阻礙了醋酸菌的生長繁殖和代謝，導致醋酸轉化酒精的能力降低[25]，產酸量過低。經多重比較分析，pH5.0時產酸量高于其它pH。因此，發酵pH5.0最佳，最終選擇pH為4.5、5.0、5.5作為響應面試驗的三個水平。

圖2 pH對醋酸發酵的影響Fig.2 Effect of pH on acetic acid fermentation

2.3 醋酸接種量對果醋發酵的影響

如圖3所示，不同醋酸菌接種量對果醋發酵影響顯著（P<0.05）。接種量10%時果醋產酸量最大，低于10%產酸量隨接種量增加而增大，高于10%產酸量開始呈現下降趨勢。可能是醋酸菌接種量過少時，發酵液中菌體不足，不能徹底發酵；而接種量過高時，發酵液中菌種增加，從而耗費大量的營養物質，而醋酸菌繁殖過快使得發酵后期發酵液中無微生物存在，進而產酸量降低[26]。經多重比較得到接種量10%對醋酸發酵的影響更顯著（P<0.05）。因此確定接種量10%為最佳，選擇8%、10%、12%三個接種量進行響應面試驗分析。

圖3 接種量對醋酸發酵的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on acetic acid fermentation

2.4 發酵溫度對果醋發酵的影響

如圖4所示，發酵溫度對果醋發酵影響顯著（P<0.05）。28~32 ℃范圍內果醋產酸量隨溫度升高而逐漸增大，溫度超過32 ℃，產酸量開始下降，溫度越高產酸量越低。可能是溫度過低時，醋酸菌中酶活性不夠，不足以充分發酵；而溫度過高會使醋酸菌中的酶活性失活，加速醋酸菌生長，提前老化，從而導致果醋產酸量降低，影響發酵效率[27]。經多重比較得到發酵溫度為32 ℃對醋酸發酵影響最為顯著（P<0.05），最終選擇32 ℃為響應值，30、32、34 ℃為三個水平進行響應面試驗分析。

圖4 溫度對醋酸發酵的影響Fig.4 Effect of temperature on acetic acid fermentation

2.5 響應面優化試驗結果

根據單因素實驗，以產酸量（R）為響應值，每個影響因素擇出三個水平即：A 初始乙醇濃度（6%、7%、8%）、B pH（4.5、5.0、5.5）、C 醋酸菌接種量（8%、10%、12%）、D 發酵溫度（30、32、34 ℃），設計響應面試驗，經Box-Benhnken[28]分析得出結果見表3。

表3 響應面試驗設計分析與結果Table 3 Response surface test design analysis and results

應用Design Expert 10軟件對表3中的數據進行回歸分析[29]，最后得到果醋產酸量的回歸方程：R=+5.46+0.18A+0.092B?0.052C+0.064D?0.01AB+0.0085AC+0.04AD?0.081BC?0.024BD+0.00625CD?0.24A2?0.26B2?0.32C2?0.24D2，對其進行方差分析，結果見表4。

結果見表4，可看出模型組的P<0.0001，說明試驗回歸方程模型極顯著；失擬項P=0.2795>0.05，不顯著，證明模型選擇正確；決定系數R2=0.9633>0.9，校正決定系數RAdj2=0.9265>0.9，證明該預測模型結果與實驗結果的擬合性好[30]，且試驗具有極小誤差。綜上所述該回歸模型可以應用于果醋的產酸量分析與預測。

表4 果醋產酸量回歸方程分析Table 4 Regression equation analysis of acid yield of fruit vinegar

各因素一次項的P值均<0.05，對果醋的產酸量影響顯著，且影響的大小順序為：A初始乙醇濃度>B pH>D溫度>C接種量。各因素的二次項P值均<0.01，影響極顯著，說明果醋產酸量的變化復雜，各因素對產酸量的影響交錯復雜。果醋產酸量受各因素的影響結果見圖5。

由圖5各因素交互影響圖所呈曲線，可看出此結果與單因素實驗結果大致相同，產酸量隨著各因素水平的遞增而呈現先增大后減小的趨勢。因交互曲線越陡峭，等高線越接近橢圓狀，則可說明這兩個因素的影響越顯著[31]，由此可知pH值與接種量的交互作用較顯著，與方差分析結果一致。經過響應面試驗優化，最終得到葡萄桑葚復合果醋的最佳工藝條件：初始乙醇濃度7.372%，pH5.089，接種量9.807%，溫度32.306 ℃，預測理論最大產酸量為5.506 g/100 mL。因實驗存在一定誤差，所以對試驗結果進行驗證。將工藝條件進行調整：初始乙醇濃度7.4%，pH5.0，接種量9.8%，溫度32 ℃，最終測得產酸量結果為5.38 g/100 mL，與響應面試驗預測的理論最大值之間存在2.3%的誤差率，說明此模型能較好地模擬和預測葡萄桑葚復合果醋的發酵工藝條件，模型可靠且具有實用性。

圖5 初始乙醇濃度、pH、接種量及溫度對果醋產酸量的交互影響圖Fig.5 Interaction of initial ethanol concentration, pH value, inoculation amount and temperature on acid production of fruit vinegar

2.6 電子鼻檢測數據分析

2.6.1 果醋不同發酵時期的響應雷達圖分析 電子鼻的10個傳感器對不同濃度氣味的敏感度不同，當傳感器接觸到樣品氣味時，相對電導率的比值（G/G0）隨氣體濃度增加而變化：G/G0>1，樣品響應氣體濃度大；G/G0≤1，樣品氣體濃度低或沒有。據前人研究發現，經雷達圖分析W5S、W1S、W1W及W2S傳感器對不同蘋果酒的香氣響應最明顯，初步判定酒中的氮氧化物、萜烯類物質、醇類物質及部分芳香族化合物是影響不同蘋果酒風味的主要差異[32]。而本文對于不同發酵時期果醋的響應雷達圖如圖6所示，可知10個傳感器對果醋不同發酵時期均有響應且不同，雷達圖形狀與面積隨果醋的發酵而發生變化，而發酵中期與成品果醋的雷達圖整體形狀相似，說明從發酵中期開始到發酵完成果醋氣味相同且濃度不斷增加。果汁中6號、8號傳感器的響應強度變化最大，發酵中期2號、7號傳感器響應強度變化最大，成品果醋2號、5號及7號傳感器響應強度變化最大且與發酵中期相比均有顯著增加；從而可知醋酸發酵對果醋的硫化物、氮氧化物及短鏈烷烴芳香類等風味成分的提升有顯著影響，且不同發酵時期的風味成分存在明顯差異。

圖6 果醋不同發酵時期的電子鼻響應雷達圖Fig.6 Radar diagram of electronic nose response in different fermentation stages of fruit vinegar

2.6.2 果醋不同發酵時期的PCA分析 PCA即主成分分析，是一種在原始維度上轉換為一種新的維度同時保留原始的數據信息的數據降維算法。一般第一主成分（PC1）的貢獻率遠大于第二主成分（PC2）的貢獻率[33]，且兩者總貢獻率超過85%就可以反映原始數據的信息[34]。果醋的不同發酵時期的PCA分析如圖7所示，每個橢圓代表不同發酵時期果醋風味成分的數據采集點，點之間距離表示每個樣品之間的差異性大小。圖中PC1貢獻率為94.70%，PC2貢獻率為5.25%，總貢獻率為99.95%。其中成品果醋的PC1和PC2的濃度均為最大，發酵中期兩種主成分均為最小，且果汁與成品果醋的PC2的氣味最為相似。發酵中期果醋的風味成分與果汁和成品果醋差別很大。

圖7 不同發酵時期果醋的PCA分析圖Fig.7 PCA analysis diagram of fruit vinegar at different fermentation stages

2.6.3 果醋的Loading分析 Loading分析是針對電子鼻傳感器分析，薛友林等[35]對貨架期藍莓的揮發性成分進行載荷分析，發現W5S傳感器貢獻率最大，得出氮氧化合物為藍莓中含量最高的揮發性成分。本研究結果如圖8所示，其中W3S、W1C、W6S三個傳感器的PC1和PC2貢獻率近似為0，說明其無法識別果醋中的風味成分。其中W5S傳感器PC1貢獻率最高，W1W傳感器PC1貢獻率僅低于W5S；W1S傳感器PC2貢獻率最高，W5C、W3C、W2S三個傳感器PC2貢獻率低于W1S且近似。參照各傳感器的性能特征可知，W5S（氮氧化物）、W1W（硫化物）兩種風味成分對葡萄桑葚復合果醋不同發酵時期的差異有主要貢獻。

圖8 果醋的Loading分析圖Fig.8 Loading analysis diagram of fruit vinegar at different fermentation stages

2.6.4 果醋不同發酵時期的LDA分析 LDA分析亦線性判別分析，是通過縮小組內間距，擴大組間間距進行判別。就LDA分析來說，PC1和PC2的總貢獻率在70%~85%之間或以上，則方法可以使用[36]。每組樣品之間的差距表示樣品風味成分變化速率大小。如圖9所示，PC1貢獻率為99.01%，PC2貢獻率為0.99%，總貢獻率99.998%，離散度大，說明果汁到發酵中期過程果醋的風味速率變化大，且果醋的三個不同發酵時期的風味成分可以很好地區分開。

圖9 不同發酵時期果醋的LDA分析圖Fig.9 LDA analysis diagram of fruit vinegar in different fermentation stages

3 結論

本研究通過單因素實驗和響應面試驗，得到葡萄桑葚復合果醋的最優工藝條件為：初始乙醇濃度7.4%，pH5.0，接種量9.8%，溫度32 ℃，在此發酵條件下，測得果醋產酸量為5.38 g/100 mL。經電子鼻技術并結合PCA和LDA分析，最終確定氮氧化物和硫化物等主要風味成分對葡萄桑葚復合果醋不同發酵時期差異的貢獻率最高，且不同發酵時期的風味成分有顯著差異并能有效區分，其中成品果醋的氣味濃度最大。該研究主要以葡萄和桑葚為原料，采用自篩醋酸菌進行發酵，其中在成品葡萄桑葚復合果醋的具體風味成分、感官評定及品質分析等后續研究中有待進行系統性深入研究，以期為復合果醋的研究和開發進行深入推廣。