紅花煙草葉片愈傷組織誘導與植株再生

董行健,余宗波

(1.華中農業大學 生命科學技術學院，武漢 430070；2. 武漢益錦祥生物環保有限公司，武漢 430070)

1 背景介紹

煙草是一種一年生或有限制性的多年生的草本植物，全株被細毛，基生稍木質化，在夏天和秋天開花。煙草原產于南美洲，在我國南方各省和地區種植廣泛，主要用途是作為煙草工業的原料，以及用于農藥，藥用麻醉，催汗，鎮定，催吐等。[1]煙草是研究細胞工程中細胞脫分化和再分化的理想材料，也是獲得遺傳變異和改善農藝性狀的重要材料。與此同時，煙草愈傷組織也是細胞生物學，分子生物學和遺傳學基礎研究的重要實驗材料。[2]細胞工程是生物工程的一個重要分支學科，是細胞生物學與遺傳學的交叉領域，主要利用細胞生物學的原理和方法，結合工程學的技術手段預先設計，有計劃地改變或創造細胞遺傳性的特性。目前細胞工程主要的技術包括細胞培養，細胞融合，對染色體的操作，基因的轉移等。[3]胼胝質又稱愈傷組織，是植物中一種由實質細胞組成的一種不形成特定結構的組織，通常出現在植物的傷口部位。18世紀，法國植物學家亨利 路易斯觀察了植物傷口的愈合過程，首次描述了愈傷組織的形成過程。來自未成熟胚胎誘導的愈傷組織可以多次再生，[4]而來源于成熟胚胎誘導的愈傷組織不可再生。基因、激素、光照均可以影響愈傷組織的再生。[5]在本實驗中，建立了煙草愈傷組織的組織培養再生體系。

2 材料和方法

2.1 植物材料

紅花煙草(Nicotianaxsanderae)由華中農業大學生命科學技術學院提供的種子。

誘導培養基：

MS 19.45 g/L

BA 0.20 mg/L

NAA 0.20 mg/L,

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L

分化培養基：

MS 19.45 g/L

BA 0.80 mg/L

NAA 0.20 mg/L

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L

1% NaOH或者1% HCL調節pH值至5.8-6.0

2.2 方法

2.2.1 配置煙草愈傷組織誘導培養基：

MS 19.45 g/L

BA 0.20 mg/L

NAA 0.20 mg/L,

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L,

加入2/3至3/4體積的雙蒸水，用NaOH和HCI攪拌溶解調節pH至5.8-6.0。將燒杯放置于電爐上，加入瓊脂然后攪拌并加熱5分鐘使之完全溶解，然后用蒸餾水固定到500 ml的體積，繼續加熱幾分鐘并混勻，分裝到12個三角瓶。然后用標記筆依次標記。在高壓蒸汽滅菌鍋滅菌已包裝的培養基(滅菌條件為121攝氏度，1.1kg/cm2的壓力)經過20分鐘滅菌，將誘導培養基放置入滅菌室。

2.2.2 煙草愈傷組織分化培養基的配置：

MS 19.45 g/L

BA 0.80 mg/L

NAA 0.20 mg/L

Agar 7.0 g/L

Sucrose 15.0 g/L

加入2/3-3/4體積的蒸餾水，攪拌后溶解，加入NaOH和HCL 調整 pH至 5.8-6.0.將燒杯放置在電爐上, 然后攪拌加熱約五分鐘并加入瓊脂至完全溶解再用蒸餾水定容至500 ml. 繼續加熱幾分鐘并攪拌均勻并均勻分裝到12個三角瓶.然后用記號筆分別標記，在高壓蒸汽滅菌鍋滅菌已分裝好的培養基。

(滅菌溫度為121攝氏度，壓強為1.1kg/cm2)經過20分鐘滅菌，將分化培養基放置入滅菌室)

2.2.3 煙草葉片接種和培養條件

用75%乙醇擦洗超凈臺，將材料，工具，12瓶誘導培養基等放入臺面。紫外燈滅菌15分鐘后，打開風扇開始接種操作。關閉紫外燈，點燃酒精燈，通過酒精燈干熱滅菌鑷子和手術刀。取一無菌皿和一兩片無菌的幼葉，在無菌皿中用滅菌的解剖刀將幼葉切割成5mm2左右的小片，然后將其接種于準備好的培養基上，每瓶接種5小片。快速封號瓶口，用記號筆寫上姓名和接種日期。接種后的煙草6瓶放于黑暗培養，6瓶放于光照培養。光周期為12小時/每天，培養溫度為24攝氏度。可以觀察到愈傷組織的誘導過程。在外植體切割過程中，動作要快,以免失水而影響生長。每完成一次操作后，及時將鑷子，解剖刀插入酒精瓶中,下次使用前需將酒精烤干消毒后再使用。

2.2.4 煙草葉片誘導情況的觀察

仔細觀察接種的煙草葉片的愈傷組織和不定芽的誘導情況，比較了光照和黑暗條件下愈傷組織誘導情況的差異，記錄并分析原因。

2.2.5 將煙草葉片從誘導培養基接種入分化培養基

14天后，將愈傷組織從誘導培養基轉到分化培養基。用75%乙醇擦洗超凈臺，將材料，鑷子，解剖刀，培養基等放入超凈臺。紫外線滅菌15分鐘后開始操作。雙手消毒，進入超凈臺開始接種。關閉紫外燈，點燃酒精燈，在酒精燈下烘烤鑷子和解剖刀。將煙草愈傷組織從誘導培養基轉移到分化培養基。每瓶接種5片煙草愈傷組織，共接種12瓶。迅速密封瓶口，用記號筆寫好姓名和接種日期。

接種后，所有愈傷組織每天以10小時/天的光周期培養，培養溫度為24°C，培養63天，觀察不同光照條件下誘導的愈傷組織的是否生成不定芽以及不定芽的數量和愈傷組織再分化的狀態，并作出記錄。

2.3 數據統計和分析

經過63天的再分化誘導，觀察12瓶分化培養基中愈傷組織的狀態先觀察整體情況:是否出現污染，是否每一瓶分化培養基都有再生植株。最后，將再生外植體從分化培養基中取出并做如下工作：

(1)對再生植株數量的統計，收集在光照和黑暗誘導下的愈傷組織并做統計計算;

(2)統計每一瓶分化培養基中的再生植株數量并計算平均每一團愈傷組織的再生不定芽;

(3)比較在光照和黑暗條件下誘導的愈傷組織的差異。

3 實驗結果

3.1 愈傷組織的誘導

先研究原始外植體誘導成愈傷組織的狀態,原始外植體(幼葉)分別在光照和黑暗條件下誘導培養14天，愈傷組織的誘導情況如表1(Table 1)顯示。我們首先觀察了愈傷組織的形態，光照和黑暗條件下誘導的愈傷組織的顏色和大小有顯著不同。在黑暗條件下誘導的愈傷組織普遍黃化(Fig.1 a),然而在光照條件下誘導的愈傷組織普遍是亮綠的 (Fig.1 b). 在光照條件下誘導的愈傷組織體積也比黑暗條件要大。

Table1 Results of callus induction from tobacco leaves

Fig.1 在不同條件下愈傷組織的誘導情況:a 一瓶典 型的煙草外植體在黑暗條件下誘導形成的愈傷組織;b 一瓶典型的煙草外植體在光照條件下誘導形成的愈傷組織。相比于光照條件，黑暗條件下誘導的愈傷組織普遍發黃并矮小，光照條件下誘導的愈傷組織普遍亮綠并體積更大，生長更加健壯

3.2 愈傷組織再分化及植株再生

把誘導培養基中的愈傷組織切除下來并在分化培養基中培養，愈傷組織進行增殖和植株再生。所有處理的試驗數據在表2(Table 2)中展示。6周后將再分化的愈傷組織從分化培養基中收集并展示在圖二(Fig.2) 。從外觀上看，在光照和黑暗條件下再分化的愈傷組織略有不同，再生植株也在顏色和形狀上略有差別(Fig.3)。

Table 2 煙草愈傷組織再生的統計結果

Table 3 Variance analysis

Fig.2 在第六周收集的再分化的愈傷組織:a一瓶典型的在黑暗中誘導的愈傷組織的再分化狀況;b一瓶典型的在光照中誘導的愈傷組織的再分化狀況。所以在早期就可以預測，在光照條件下誘導的愈傷組織長勢比在黑暗條件下誘導的愈傷組織更好，因為在光照條件下誘導的愈傷組織更有活力

Fig.3 煙草愈傷組織的再分化情況：a 5團典型的在黑暗條件下誘導的愈傷組織的再分化情況；b 5團典型的在光照條件下誘導的愈傷組織的再分化情況。我們可以得出結論：在同樣的光照再分化條件下，在黑暗條件下誘導的愈傷組織再分化后會泛黃，再分化的芽的體積較小，然而光照條件下誘導的愈傷組織再分化后體積更大，再分化的芽的數量更多。

為顯示不同誘導培養條件下愈傷組織的差異，并鑒定最好的培養條件，利用方差分析ANOVA (Analysis of Variance)且借助SAS軟件的幫助算出F值 (Fig.4)。 結果發現，在光照條件下誘導的愈傷組織的再生芽的平均數量是20.9，在黑暗條件下誘導的愈傷組織的的再生芽的平均數量為15.3，由此可見在光照條件下的愈傷組織的誘導毫無疑問比在黑暗條件下更成功。

Fig.4 數據的描述使用SAS來幫助處理原始數據。單因素ANOVA方差分析是實驗的最好模型a SAS 單因素方差分析對原始數據分析的源代碼b SAS程序方差分析的結果輸出可視化c y的分布y: 每一團愈傷組織再生的不定芽數量 1:在光照條件下誘導2: 在黑暗條件下誘導，在光照條件下平均每一團愈傷組織的再生不定芽的數量為20.9, 標準差為4.326，在黑暗條件下平均每一團愈傷組織的再生不定芽的數量為 15.33 標準差為2.796. 在光照條件下誘導的愈傷組織的平均再生不定芽數量顯著多余黑暗條件下誘導的愈傷組織。圖片通過SAS語言代碼實現可視化。

每一瓶培養基接種5團愈傷組織，共有12瓶誘導培養基 ，培養基上標注L和D,“L” or “D”. L: light condition, D: dark condition.

收集了12瓶愈傷組織，并描述了再生芽的數量，體積，顏色和堅硬度。在表中顯示了原始數據. 培養基上被標記 “L” or “D”. L: light condition, D: dark condition.

F=464.817/13.265=35.04, P(>F) <0.0001, 得出結論在光照和黑暗條件下誘導的愈傷組織在不定芽再生過程中分化不定芽的數量有顯著差別。

4 討論

4.1 光照和黑暗對愈傷組織誘導的影響

實驗分析了光照，黑暗條件對煙草葉片愈傷組織的誘導和植物再生的影響。首先，在光照和黑暗條件下誘導的愈傷組織在外觀，顏色，形態，和體積方面都有顯著差異。黑暗條件下誘導的愈傷組織一般呈黃色，體積小，光照條件下誘導的愈傷組織呈亮綠色，體積大。由此可見，光照條件更有利于植物愈傷組織的誘導和再生。先前的研究證明過光照可以促進愈傷組織的生長[6]，實驗結果與之前的研究一致。

4.2 連續光照有利于愈傷組織再分化的原因

另外，連續光照的條件有利于愈傷組織細胞再分化與維管組織的形成, 這可以解釋在光照條件下的愈傷組織可以在沒有外源激素刺激的情況下獨立分化為芽與根的現象。[7]值得注意的是，高輻射強度的光也可能可以破壞維管組織，[8]并影響愈傷組織的生長。因此光培養室的光強度應該符合自然環境，以保護愈傷組織。在分化時，將所有的愈傷組合接種到分化培養基中，轉入10h/天的光照條件。盡管在再分化階段，所有的愈傷組織都是在相同的條件下培養的，但在黑暗和光照條件下誘導的愈傷組織生成的植株有顯著差異: 在光照條件下誘導的愈傷組織在體積上更大，再分化的芽面積更大，更健壯，有的再生芽甚至長成了完整植株。[9]相比而言，在黑暗條件下誘導的愈傷組織再生的芽更矮小，絕大部分再生芽高度未超過2mm，再生芽的顏色也更偏黃。在數量上，光照條件下誘導的愈傷組織的再生芽也顯著高于在黑暗條件下誘導的。早期研究曾經提出，光照會抑制不含葉綠素的愈傷組織的細胞的再分化，[10]在黑暗中誘導的愈傷組織積累了很少或沒有積累葉綠素, 所以在被轉移到光照環境下之后，它的生長可能收到限制，導致再分化的不定芽的數量顯著少于在光照條件下誘導的積累了葉綠素的愈傷組織。另外, 光周期也是一個另外的影響愈傷組織再分化的重要因素，對于煙草愈傷組織的再分化而言，最適合的光周期是最接近自然情況的每天12-16小時。[11]晝夜節律和光周期長短不僅有利于愈傷組織再生的極性建立和模式形成，也與器官的分化相關。研究顯示，在長的光周期和低濃度蔗糖的培養條件下，紅花煙草傾向于發育成不定芽而不是生根，相比而言，短的光照周期和高濃度蔗糖的培養條件有利于愈傷組織生根和生成塊莖。[12]

4.3 在煙草外植體組織培養中出現的問題及預防和解決方案

另外一方面，雖然大部分植株再生狀況都很好，一小部分愈傷組織褐化和玻璃化是正常現象。一開始筆者認為外植體褐化是因為靠近酒精燈被灼燒的原因，但實際上褐化過程主要發生在外植體培養，愈傷組織繼代培養，懸浮細胞培養，原生質體分離和培養的過程。外植體褐化不僅影響愈傷組織的誘導，而且還會影響愈傷組織的正常的生理生化反應，進而影響愈傷組織的再分化生長。眾所周知，多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)是導致外植體和愈傷組織褐化的兩種關鍵酶。[13]在正常條件下，細胞內酚類物質和醌類物質的濃度之間保持著動態的平衡。通常醌類物質的濃度很低，但酚氧化酶和酚類物質分布在正常組織的各個部位。酚類物質分布在各個細胞的液泡中，酚氧化酶則分布在各種質體和細胞質中。質膜隔離了酚類物質和酚類氧化酶造成了這種區域性的分布。但是，當外植體或愈傷組織遭遇類似于高滲透壓，機械損傷，細胞損傷，老化，細胞膜結構或細胞器膜結構的損傷，均會導致酚氧化酶的合成和釋放。 此時，在適宜的PH和溫度條件下，酚類氧化酶，酚類，氧氣會發生氧化反應，生成有毒害的醌類物質，導致組織褐化。導致愈傷組織褐化的原因有多種，其中一個重要原因可能是實驗過程中操作不規范，導致細胞壁，細胞膜，液泡的損害，導致酚類物質和多酚氧化酶的接觸。在植物中有活性的多酚氧化酶，在有氧環境下，催化酚類物質轉化為醌類物質和水。同時，過氧化物酶也會催化生成氣態的過氧化氫，加快酚類物質氧化成醌。醌類化合物與蛋白質或其他氨基/巰基化合物自發聚集，形成棕色的產物，導致其他酶促反應系統失活，生理代謝紊亂，從而導致外植體和愈傷組織的褐化。最終培養基中的溫度過高或者光強過強，會促進褐化反應的發生。[14]同時，植物的物種，基因型，外植體的年齡，外植體在原有植株上的位置，外植體的大小，外植體培養方法都與外植體的褐化有關。為了抑制外植體的褐化并根除褐化對植物造成的傷害，可以采取一下措施；1.選擇具有較強再分化能力的外植體； 2.選擇適合的培養環境；3.縮短轉瓶繼代的時間周期;4.在培養基中加入活性炭來吸附酚類物質;5.在培養基中加入氰化鉀作為抗氧化劑，來根除醌類和半醌類物質。[15]當然必須注意評估加入的化學物質是否對外植體的生長和愈傷組織再分化有害。對于玻璃化的問題，它會導致不正常的植物形態和大小:植株會變矮小，葉片會呈透明或半透明水浸狀。解剖學特征包括:植株會矮小并腫脹, 沒有結間或結間非常短，呈玫瑰花環狀, 桿狀或其他形狀。該組織的主要表現是疏導組織發育不良，莖間分生能力較弱，芽發育狀況較差，所以難以分化和生根。玻璃化的葉片往往呈半透明的亮綠色，皺縮。薄壁組織往往過度生長，葉肉被充滿葉綠體的實質細胞充滿，柵欄組織細胞層的數量減少，海綿狀葉肉細胞之間的間隙變小，角質層缺失或僅存在薄薄的角質層，沒有典型的表皮細胞和主葉脈。總而言之，如果植株發生玻璃化，植物的生長會遭受顯著的影響，甚至會導致植物的最終死亡。[16]外植體的生理年齡，器官的類型，大小，培養條件，外植體的基因型都會對外植體的玻璃化產生影響。對于愈傷組織來說，可能是因為不佳的通氣條件[17]和缺乏能顯著降低玻璃化機率的紫外線造成的。[18]為了防止外植體的玻璃化，筆者提出以下解決方案：(1)控制光節律的每天光照時間為12-16小時/每天，如果每天光照時間超過18小時，玻璃化反應會自動發生；(2)適當提高培養基中的蔗糖和瓊脂濃度；(3)適當地降低培養基中細胞分裂素和赤霉素的濃度4.提高外植體培養基中硝態氮比銨態氮的比例。[19]有些解決方案背后的機理仍需要我們去研究。

4.4 外植體再分化的其他影響因素

當外植體經歷再分化的過程，也必須考慮一些其他的環境條件如水分。水分的影響包括培養基中的水分和外界環境中的水分。培養基中的水分受培養條件和密封薄膜的影響。經證實，如果密封膜過緊，外植體的生長會受抑制。在培養室中的水分含量跟在培養基中的水分含量一樣重要，可以利用濕度調節器將培養室的相對濕度控制在70%-80%。[20]

特別鳴謝：這項研究是由華中農業大學隸屬于生命科學技術學院生物實驗教學中心所支持的(Biology Experiment Teaching Center of College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University)。感謝華中農業大學生命科學技術學院的齊迎春教授，杜鵑副教授，陳浩副教授，謝婷婷副教授對本實驗的指導；也感謝研究生助教為實驗材料的提前準備的辛勤付出。