馬錢子苷對神經干細胞的增殖、存活和分化的調節作用

張進強，易賽妮，申琳敏，李良遠，肖承鴻，唐鑫，劉芹，蘇大鵬，胥春云，周濤

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

神經干細胞是一類具有自我更新、分裂及多向分化能力的干細胞亞群，廣泛存在于哺乳動物腦內的嗅球、海馬齒狀回、大腦皮層等部位，是構成神經發生的重要細胞基礎[1-2]。傳統認為神經發生過程只存在于胚胎發育過程中，在哺乳動物成年后，神經發生過程便會停止。但近年的研究發現，成年哺乳動物的海馬顆粒細胞下層區和室管膜下區存在一定數量的神經干細胞，在特定條件下，這些神經干細胞可分化為神經元或膠質細胞，從而參與神經功能的修復過程[3]。已有研究證明，成年哺乳動物的神經發生在腦損傷、腦缺血、癲癇和抑郁、阿爾茨海默病等疾病的治療中發揮了積極的作用，藥理學調控神經干細胞功能可為神經系統疾病的治療開辟新的研究領域[4-5]。

馬錢子苷(Loganin)為常用中藥山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)的主要活性成分，又名馬錢素、番木鱉苷，屬于環烯醚萜類化合物，已發現其有良好的抗炎、免疫調節及神經保護作用[6]。本實驗基于馬錢子苷對神經系統的調節作用，從成年小鼠大腦中分離培養神經干細胞，觀察不同濃度的馬錢子苷對神經干細胞增殖、存活和分化的影響，為神經干細胞治療中樞神經系統疾病的研究奠定理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

成年C57BL/6J小鼠(8周齡)購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司(質量合格證號SCXK(湘)2019-0014)；DMEM/F12高糖培養基(貨號：12400-024)、表皮生長因子蛋白EGF(貨號：PHG0311)、N 2 Supplement(貨號：17502048)、B-27添加劑(貨號：17504-044)購自美國Gibco公司；細胞生長因子FGF(貨號：13256029)購自美國Invitrogen公司；抗支原體試劑(貨號：1944020)、青鏈霉素混合液(貨號：P1400)購自北京索萊寶科技有限公司；GFAP抗體(貨號：80788S)、MAP2抗體(貨號：8707S)、BrdU抗體(貨號：5292S)購自美國Cell Signaling Technology公司；Olig 2抗體(貨號：ab236540)購自美國Abacm公司；馬錢子苷(貨號：FY1475，純度98%)、水合氯醛(貨號：302-17-0)購自四川生物工程有限公司。

1.2 神經干細胞的分離與培養

成年C57BL/6J小鼠用水合氯醛麻醉，用75%的乙醇浸泡消毒10 s，于超凈工作臺中頸椎脫臼處死，取出完整大腦放入裝有無菌PBS的培養皿中，剝去腦膜，保留神經干組織轉移至裝有無菌PBS的培養皿中，吹打，使組織分散后移至15 mL離心管內，500 r/min離心2 min，棄上清，迅速加入0.25%胰酶細胞消化液1 mL，于37 ℃水浴鍋中消化5 min，加入胎牛血清終止消化，1200 r/min離心5 min，棄上清，加入6 mL增殖培養基(含有94.29% DMEM/F12高糖、1.94% B-27、0.97% N2、20 ng/mL的EGF、FGF各0.19%、1.21%雙抗和1.21%抗支原體試劑)。將細胞懸液稀釋到1×105并接種于24孔板中,放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。每天利用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況并拍照記錄。

1.3 神經干細胞增殖培養及藥物處理

收集生長狀態良好的第二代神經干細胞球，500 r/min離心3 min，棄上清，加1 mL胰酶吹打，5 min后加入3 mL DMEMF12，1000 r/min離心5 min，去上清，加入增殖培養基至6 mL，接種于24孔板中，放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。細胞分為4個組，分別為空白組(用無血清培養基培養)、馬錢子苷處理組(濃度分別為50、100、200 μmol/L 3組)。每組3個復孔，連續7 d觀察并拍照記錄各組神經球的直徑和數量。

1.4 神經干細胞分化培養及藥物處理

收集生長狀態良好的第二代神經干細胞球，500 r/min離心3 min，棄上清，加入3 mL分化培養基(含89.9% DMEM/F12高糖、0.9% N2、1.8% B-27、1.2% 雙抗、1.2% 抗支原體、5% 驢血清)吹打，1000 r/min離心5 min，去上清，加入分化培養基至6 mL，接種于24孔板中，放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。細胞分為4個組，分別為空白組(用分化培養基培養)、馬錢子苷處理組(濃度分別為50 、100、200 μmol/L 3組)，每2 d進行半量換液，吸除各孔500 μL分化培養基，再各加500 μL新的分化培養基。每組3個復孔，連續觀察，7 d后進行免疫熒光染色。

1.5 細胞固定及免疫熒光染色

在神經干細胞有絲分裂研究中，神經干細胞培養6.5 d后，用100 ng/mL的5-溴-2-脫氧脲苷(BrdU)處理神經干細胞，12 h后進行細胞固定。在分化研究中，分化培養的神經干細胞在培養第7 d進行固定。細胞固定時，吸棄24孔板中的分化培養基，各孔中加500 μL 4%多聚甲醛固定30 min，加入300 μL的0.5%的TritonX-100通透15 min，加300 μL的10% 驢血清封閉1 h，吸去驢血清，每孔加一抗(BrdU、MAP 2、GFAP、Olig 2)，4 ℃孵育過夜。24 h后PBS洗滌3次，每次3 min，避光下加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，最后滴加5 μL抗熒光衰減封片劑，取出載玻片，用蓋玻片覆蓋，在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察。

1.6 顯微成像及圖片分析

將分化培養的神經干細胞空白組和給藥馬錢子苷組中的3個復孔各選具有代表性的5個視野連續7 d拍照并觀察細胞生長情況。培養7 d后分化的神經干細胞經免疫熒光染色送往Servicebio公司進行普通切片掃描(熒光雙標，三色)。將切片掃描后的圖片經過CaseViewer軟件打開，空白組和馬錢子苷組的各3個復孔均選取5個具代表性視野截屏，然后借助ImageJ軟件計數并統計。

1.7 數據統計及顯著性分析

2 結果與分析

2.1 馬錢子苷對神經干細胞增殖和存活的影響

將培養的成年神經干細胞分離成單細胞，細胞邊緣具有折光性(圖1(a))。分離培養3 d的神經干細胞是由5～25個單細胞聚集而成的球形(圖1(b))；分離培養5 d后，神經干細胞由12～65個單細胞聚集而成，體積相對增大，神經球邊緣較規整(圖1(c))；分離培養7 d后，神經干細胞由20～110個單細胞聚集而成神經球，體積大，神經球直徑約150 μmol/L，邊緣規整且折光性強。

圖1 成年小鼠神經干細胞純化Fig.1 Purification of adult mouse neural stem cells

在不同濃度馬錢子苷干預下，增殖培養1 d和3 d的神經干細胞細胞直徑和神經球數量與對照組相比均無明顯差異(P>0.05)(圖2(a)、2(b))；神經干細胞在含有低、中、高濃度(50、100、200 μmol/L)馬錢子苷的增殖培養基中培養5 d后，各組神經球的直徑均明顯變大(P<0.05)，其中，馬錢子苷低、中、高劑量組的神經球直徑分別增加了28.0%、30.4%、41.6%，與此同時，馬錢子苷中、高劑量組中神經干細胞成球的數量在培養5 d后與對照相比也顯著增加(P<0.05)，分別增加了53.8%和34.6%；而低劑量組的神經球數量與對照相比無明顯變化(P>0.05)(圖2(c))。神經干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的增殖培養基中培養7 d后，各組神經球的直徑與對照相比進一步增大(P<0.05)，神經球直徑分別增加了20.6%、33.3%、46.6%，與此同時，馬錢子苷低、中、高劑量組中神經干細胞成球的數量在培養7 d后與對照相比也顯著增加(P<0.05)，分別增加了44.4%、66.6%和63.8%(圖2(d))。

注：A～D為增殖培養的神經干細胞顯微圖；E和F為增殖培養的神經球直徑及數量統計圖；CK為對照組，數據顯示為*P<0.05，**P<0.01 ,***P<0.005 相比CK組,單因素方差分析。圖2 馬錢子苷干預對神經干細胞增殖和存活的影響Fig.2 Effects of Loganin on the proliferation and survival of neural stem cells

2.2 馬錢子苷對神經干細胞有絲分裂的影響

單細胞增殖活性檢測結果顯示，神經干細胞在含有中、高劑量馬錢子苷的增殖培養基中培養12 h后，完成有絲分裂的神經干細胞(BrdU陽性標記)的細胞數量與對照組相比有顯著增加(P<0.05)，而低劑量組的BrdU陽性標記的神經干細胞數量與對照相比無明顯變化(P>0.05)(圖3)。

注：A～D，有絲分裂后的神經干細胞的免疫熒光染色圖，BrdU(綠色)標記完成有絲分裂后的細胞，DAPI(藍色)標記所有細胞核；E為各組中完成有絲分裂的神經干細胞占總細胞的百分比；CK為對照組，數據顯示為相比CK組，單因素方差分析。圖3 馬錢子苷干預對神經干細胞有絲分裂的影響Fig.3 Effects of Loganin on the caryomitosis of neural stem cells

2.3 馬錢子苷對神經干細胞分化的影響

神經干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養基中培養3 d后，采用免疫細胞化學染色檢驗神經干細胞的分化情況。結果顯示，與對照組相比，低劑量馬錢子苷處理組的神經干細胞發生分化的比率由60.3%增加到74.5%(P<0.01)，而未分化的神經干細胞的比例由39.7%減少到25.5%(P<0.01)；而馬錢子苷中、高劑量組的神經干細胞分化率被顯著抑制(P<0.05)，未分化的神經干細胞的比例顯著升高(P<0.05)(圖4)。

注：CK為對照組，數據顯示為*P<0.05，**P<0.01 相比 CK組，單因素方差分析。圖4 馬錢子苷干預對神經干細胞分化的影響Fig.4 Effects of Loganin on the differentiation of neural stem cells

2.4 馬錢子苷對神經再生的影響

神經干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養基中培養7 d后，采用免疫細胞化學染色檢驗神經再生情況。結果顯示，與對照組相比，低劑量馬錢子苷處理后，MAP2標記的細胞(神經元)數量及比例顯著增加(P<0.01)，馬錢子苷中劑量組的MAP2標記的細胞數量及比例無明顯變化(P>0.05)，馬錢子苷高劑量組的MAP2標記的細胞數量及比例顯著減少(P<0.05)(圖5)。

注：A1～D2為神經干細胞向神經元分化的免疫熒光染色圖，MAP2(紅色)標記神經元，DAPI(藍色)標記所有細胞核；E和F為統計各組中神經元的數量及分化比例；CK為對照組，數據顯示為 相比CK組，單因素方差分析。圖5 馬錢子苷對神經再生的影響Fig.5 Effects of Loganin on neurogenesis

2.5 馬錢子苷對星形膠質細胞再生的影響

神經干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養基中培養7 d后，采用免疫細胞化學染色檢驗星形膠質細胞再生情況。結果顯示，與對照組相比，低劑量馬錢子苷處理后，GFAP標記的細胞(星形膠質細胞)數量及比例顯著增加(P<0.05)，馬錢子苷中、高劑量組的GFAP標記的細胞數量及比例無明顯變化(P>0.05)(圖6)。

注：A1～D2為神經干細胞向星形膠質細胞分化的免疫熒光染色圖，GFAP(綠色)標記星形膠質細胞，DAPI(藍色)標記所有細胞核；E和F為統計各組中星形膠質細胞的數量及分化比例；CK為對照組，數據顯示為 相比CK組，單因素方差分析。圖6 馬錢子苷對星形膠質細胞再生的影響Fig.6 Effects of Loganin on astrocyte regeneration

2.6 馬錢子苷對少突膠質細胞再生的影響

神經干細胞在含有低、中、高濃度馬錢子苷的分化培養基中培養7 d后，采用免疫細胞化學染色檢驗少突膠質細胞再生情況。結果顯示，與對照組相比，馬錢子苷低、中、高劑量組的Olig 2標記的細胞(少突膠質細胞)數量及比例無明顯變化(P>0.05)(圖7)。

注：A1～D2為神經干細胞向少突膠質細胞分化的免疫熒光染色圖，Olig 2(紅色)標記少突膠質細胞，DAPI(藍色)標記所有細胞核；E和F為統計各組中少突膠質細胞的數量及分化比例；CK為對照組。圖7 馬錢子苷對少突膠質細胞再生的影響Fig.7 Effects of Loganin on oligodendrocyte regeneration

3 討論

成年哺乳動物大腦中的神經干細胞是一類具有增殖和分化潛能的干細胞亞群，在神經組織受損時，神經干細胞經歷增殖、分化、遷移、存活和成熟等一系列過程，將新生神經元整合到受損腦區，取代受損神經細胞，并建立新的神經通路，從而起到神經組織修復的作用[7-11]，提高神經干細胞的增殖和分化能力有利于神經組織的修復。本研究發現成年小鼠神經干細胞在含有中、高濃度馬錢子苷的增殖培養基中培養5 d后，神經球的數量與對照相比顯著增加，表明中、高劑量的馬錢子苷能夠促進成年小鼠神經干細胞的存活。這與以前報道的結果相一致[12]。神經干細胞增殖過程通常與其有絲分裂的速度有關[3]。本研究發現，中、高劑量的馬錢子苷能夠促進神經干細胞的有絲分裂過程，并增加神經球的直徑，表明中、高劑量的馬錢子苷能夠通過促進成年小鼠神經干細胞的有絲分裂活性來提高其增殖能力。

在適宜條件下，神經干細胞能夠分化成神經元、星形膠質細胞或少突膠質細胞，該過程稱為細胞的“命運決定”[2]。在神經干細胞分化的過程中，特殊藥物的干預能夠影響細胞的命運決定[10-12]。本研究發現，低劑量馬錢子苷處理顯著促進神經干細胞發生分化，并增加神經元和星形膠質細胞的數量及比例，這一結果表明低劑量的馬錢子苷為神經干細胞提供了一個適宜于分化的條件，有利于神經元和星形膠質細胞再生。但中、高劑量馬錢子苷會減少分化的神經干細胞數量，原因可能在于高濃度的藥物干預對于細胞來說是一個危險信號，這種危險信號可促進神經干細胞數量的增多，并累積大量未分化的神經干細胞，這些累計的細胞可分化為神經元和星形膠質細胞等從而應對風險。故高濃度的馬錢子苷更偏向于促進神經干細胞的增殖，相當于為神經干細胞提供一個足夠的、可供分化的“庫存”。

神經干細胞的增殖和分化并非是兩個相互獨立的過程，在成年哺乳動物大腦中，通常需要維持一定數量的神經干細胞[3]。因此，在正常生理條件下，神經干細胞的增殖和分化幾乎是同步進行的。但是，在病理條件下，神經干細胞的增殖能力可能會受到抑制，進而影響新生神經元的數量，神經元代償不足而導致病情惡化。藥物對神經干細胞增殖分化的調節作用均有明顯的劑量效應，濃度過高或過低都有可能呈現相反的效果[10]。本研究發現50 μmol/L的馬錢子苷能夠促進神經干細胞分化，同時也能輕微地促進神經干細胞增殖，提示該劑量可能是一個較好的處理劑量。中、高劑量的馬錢子苷能夠顯著促進神經干細胞增殖，但會抑制神經干細胞分化，這一結果提示，在治療疾病時，可先用高劑量馬錢子苷誘導神經干細胞增殖，讓體內形成大量神經干細胞，再用低劑量馬錢子苷誘導神經干細胞分化，便可形成最多數量的新生神經元。這些研究結果可為神經疾病的藥物治療提供線索。