基于網絡藥理學預測丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的作用機制

孫丹丹，姜婷，王剛，胡勇

(青島市中醫醫院 ，山東 青島 266033)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是指長期大量攝入酒精所致的肝臟損傷[1]，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化，甚至會發展為肝癌[2]。肝癌是最致命的癌癥之一，是我國第二常見癌癥[3]。目前西醫主要是在戒酒、營養支持的基礎上采用藥物治療，而中醫藥對酒精性肝病具有較好的治療效果[4-5]。丹參具有心肌保護、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等藥理作用[6]，柴胡具有免疫調節、抗抑郁、保肝、抗腫瘤、退熱、抗炎等藥理作用[7]。現代研究表明，逍遙散(君藥柴胡)能降低酒精對肝臟的損傷，降低大鼠血清中天門冬氨酸氨基轉移酶 (AST)和丙氨酸氨基轉氨酶 (ALT)的含量，降低肝組織中丙二醛 (MDA)含量，提高肝組織谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，逍遙散可抑制氧化應激和脂質過氧化反應來降低肝細胞的損傷[8]。丹參中的丹酚酸B可降低小鼠肝中ALT、AST、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的含量，其作用機制是降低TNF-α和IL-6水平,通過激活SIRT1來降低CRP和ChREBP的表達[9]。基于數據挖掘發現用丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的使用頻次最高[10]，但丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的藥效物質基礎和作用機制尚不明確。因此，本研究采用網絡藥理學方法，對丹參-柴胡藥對的主要化學成分及其治療酒精性肝病的作用機制進行系統地預測分析，為丹參-柴胡藥對的后續實驗研究提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 篩選丹參-柴胡的化學成分和靶點基因

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmspsearch.php)，分別輸入丹參、柴胡，得到其主要化學成分和靶點基因。選擇口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug like,DL)≥0.18的篩選條件，獲得丹參、柴胡的化學成分。通過UniProt數據庫 (https://www.uniprot.org/)，限定物種為“Homo Sapien”，將化學成分的相關靶點轉化成相應的基因。通過SwissTargetPrediction 數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，預測化學成分的潛在基因靶點。將UniProt數據庫和SwissTargetPrediction 數據庫搜索到的化合物基因靶點合并，刪除重復基因，獲取丹參-柴胡的靶基因。

1.2 酒精性肝病的靶點搜集

選擇酒精性肝病關鍵詞“alcoholic liver disease”，通過人類基因綜合數據庫(GeneCards)(https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM)(https://omim.org/)，得到疾病相關基因。將疾病基因與藥物基因映射，選出交集基因，即藥物治療疾病的潛在靶基因。

1.3 成分靶點網絡的構建

創建“藥物與成分”“成分與靶點”“疾病與靶點”關系的文件，利用Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡構建。在該網絡中，化合物和靶點用節點(node)代表，化合物與靶點間的相互聯系用邊(edge)代表。為了分析網絡拓撲屬性，可以參照網絡拓撲參數：節點度、節點介度和節點緊密度。

1.4 靶蛋白相互作用網絡的構建

通過String平臺(https://string-db.org/)，構建靶蛋白蛋白質-蛋白質相互作用(protein-proteir interaction,PPI)網絡，物種為“Homo Sapiens”，等值置信度為0.4、0.7和0.9，其余參數為不變。下載蛋白質-蛋白質中的tsv文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件進行拓撲屬性分析。

1.5 基因功能和通路富集分析

通過Metascape平臺，分析丹參-柴胡對抗酒精性肝病的關鍵靶點，輸入物種和分析物種為“Homo Sapiens”，進行基因本體(gene ontology,GO)注釋分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析，篩出排名靠前的生物過程和通路。

2 結果與分析

2.1 丹參-柴胡藥對主要活性成分篩選

用TCMSP數據庫，得到202個丹參活性成分、349個柴胡活性成分，篩選后，得到65個丹參候選化合物、17個柴胡的候選化合物，刪除9個無靶點成分，共得73個活性成分，見表1。

表1 丹參、柴胡的主要有效活性成分Table 1 The main effective active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix

2.2 丹參-柴胡藥對作用靶點預測

通過TCMSP數據庫，檢索出932個丹參靶點、348個柴胡靶點，分別刪除重復項，獲得139個丹參靶點、197個柴胡靶點；基于SwissTargetPrediction平臺，獲得69個丹參靶點、134個柴胡靶點，分別合并兩個數據庫基因，重復項刪除，得到162個丹參靶點、251個柴胡靶點。

2.3 丹參、柴胡藥對治療酒精性肝病的靶點預測

通過GeneCard數據庫，獲得7685個酒精性肝病相關靶基因，以Relevance score值≥21.69為標準，篩選出963個靶基因。利用OMIM數據庫找到519個與酒精性肝病相關的基因。合并基因并刪除重復基因，得到1411個疾病相關基因。將藥物與疾病的靶點基因進行映射，得到交集基因，丹參治療酒精性肝病的潛在靶點98個、柴胡137個，將重復項刪除，得到161個靶基因，預測為丹參-柴胡藥對治酒精性肝病的靶基因。

2.4 成分靶點網絡圖

圖1所示為成分靶點網絡圖，圖1編號見表2。161個丹參-柴胡藥對的靶基因建立成分靶點網絡圖，共有節點184個、邊256條。活性成分及靶點用節點代表，活性成分與靶點的相互聯系用邊代表。丹參-柴胡藥對具有多成分、多靶點治療酒精性肝病的作用機制。

注：黃色表示丹參TCMSP編號活性成分，紫色表示柴胡TCMSP編號活性成分，藍色表示丹參、柴胡共有的TCMSP編號活性成分，綠色表示治療酒精性肝病潛在靶點。圖1 丹參、柴胡活性成分-酒精性肝病靶點網絡Fig.1 Network of the active ingredient targets of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix for the treatment of alcoholic liver disease

表2 圖1編號注釋Table 2 Numbered notes for Figure 1

經計算，該網絡的連接度(degree)平均值是2.78，介度(BC)平均值是0.01，緊密度(CC)平均值是0.3。槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山奈酚、丹參酮IIA、植物甾醇、黃芩苷等7種成分的拓撲參數均大于其平均值，這些成分可能是丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的主要活性成分。主要活性成分的拓撲參數見表3。

表3 主要活性成分拓撲參數Table 3 Topological parameters of the main active ingredients

2.5 靶蛋白PPI網絡分析

圖2所示為PPI網絡圖，中等置信度=0.4時，共有節點161個，邊3273條。通過計算，整個網絡degree的中位數=34，選擇degree≥68為候選靶點，同時BC和CC的值也選擇大于中位數的靶點為關鍵靶點26個。將26個基因靶點導入UniProt平臺，得到基因對應的蛋白名稱，見表4。

圖2 丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病靶蛋白PPI網絡Fig.2 PPI network of the target proteins of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix for the treatment of alcoholic liver disease

表4 26個中心靶點信息Table 4 Information regarding the 26 hub targets

2.6 GO注釋分析和KEGG富集分析

利用Metascape數據庫，GO注釋分析和KEGG通路分析161個基因靶點，利用GraphPad Prism8.0軟件，將分析結果可視化。結果見圖3。

GO注釋分析包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)三部分。由圖3可知，BP(圖3(a))中主要有對無機物的反應、對有毒物質的反應、細胞因子介導的信號通路、對受傷的反應等。CC分析(圖3(b))中主要是膜筏、枝晶、受體復合體、細胞質核周區域、核體、裂解液泡等。MF分析(圖3(c))主要是轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶結合、蛋白質均二聚活性、氧化還原酶活性等。

KEGG通路分析(圖3(d))，丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病靶點涉及的通路中，主要有腫瘤信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、內分泌抵抗、癌癥中的轉錄失調等。

圖3 丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病潛在靶點的GO注釋分析與KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analyses of the potential targets of Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma and Bupleuri Radix for the treatment of alcoholic liver disease

3 討論

酒精性肝炎是由于過量飲酒引起的肝組織炎癥和壞死，甚至會引起器官衰竭。丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，柴胡具有透表泄熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效[11]。丹參-柴胡藥對的主要化學成分有：槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山奈酚、丹參酮IIA、植物甾醇、黃芩苷等。現代研究表明，槲皮素是多酚類中的一種黃酮化合物，具有自由基清除能力和抗炎作用，槲皮素可以通過上調IL-10和HO-1的表達，從而抑制NLRP3炎性體的激活和炎性因子的分泌，從而保留肝臟在急性酒精中毒中的功能[12]；槲皮素可通過維持氧化還原穩態、調節細胞信號通路、抑制炎癥因子釋放、控制相關酶的合成與釋放等方面對化學性肝損傷發揮抗氧化和抗炎活性[13]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，可以抑制酒精誘導的脂質蓄積、脂肪形成基因表達，還可以抑制酒精誘導的AMP活化蛋白激酶的還原、SREBP-1c的磷酸化[14]。異鼠李素為槲皮素的直接衍生物，具有很好的抗炎、抗氧化、抗過敏等藥理作用，可通過抑制脂肪的生成降低肝內的脂肪和甘油三酯[15]。山奈酚為一種黃酮類化合物，可以逆轉酒精性肝損傷小鼠回腸和近端結腸中TJ蛋白ZO-1和閉塞素、丁酸受體和丁酸轉運體的表達，從而預防酒精性肝損傷[16]；山奈酚可通過降低CYP2E1的活性和表達、增強抗氧化防御系統，從而保護酒精引起的肝損傷[17]。黃芩苷為一種黃酮類化合物，可以通過抑制氧化應激、炎癥反應、調節生刺猬通路等途徑，保護酒精所致的肝損傷[18]。丹參酮IIA、植物甾醇也具有保護肝臟細胞的作用[19-20]。

通過構建關鍵靶基因PPI網絡，得到PPI網絡的核心基因，AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、EGF位于基因核心位置。AKT1(蛋白激酶B,PKB)是一種大分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在暴飲酒精所致的肝損傷中，AKT1可促進纖維化標志物的表達，因此可靶向抑制AKT1進行治療[21]。IL6是一種促炎因子，參與急性肝損傷的發生和發展，可導致肝細胞及線粒體的損害，抑制IL6在血液循環中的表達，可保護肝臟功能[22]。TP53突變是肝細胞癌中最常見的基因突變，會導致肝細胞癌免疫反應下調，312個免疫應答相關基因中有37個是與TP53突變而差異表達[23]。VEGFA是一種保護脂肪肝的基因，可通過VEGFR2-PI3K/Akt途徑保護肝臟[24]。TNF、CASP3兩種基因的產生都會導致肝臟的損傷[25-26]。

丹參和柴胡的GO注釋分析主要有對無機物的反應、對有毒物質的反應、細胞因子介導的信號通路、對受傷的反應、膜筏、枝晶、受體復合體、細胞質核周區域、核體、溶泡、轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶結合、蛋白質均二聚活性、氧化還原酶活性等，KEGG分析主要有腫瘤信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、內分泌抵抗、癌癥中的轉錄失調等。

中藥網絡藥理學中可能存在尚未發現的丹參、柴胡的活性成分。網絡藥理學研究主要依賴于公共數據庫，其準確性、可靠性、完善性對預測結果有很大影響，再者，網絡藥理學對于方劑中藥物的不同配比無法確定，故也存在一定的局限[27]。

綜上所述，根據中藥網絡學的研究方法，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，闡述了丹參-柴胡藥對治療酒精性肝病的作用機制是多成分、多靶點、多通路，未來將進行分子生物學驗證，并結合體內外實驗進行進一步驗證。