馬錢子苷對小膠質細胞活化的抑制作用

易賽妮，張文嬌，李良遠，肖承鴻，唐鑫，劉芹，蘇大鵬，胥春云，張進強，周濤

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

小膠質細胞是中樞神經系統的固有免疫細胞，在突觸連接和去除凋亡細胞中起到重要作用[1]。在正常情況下，小膠質細胞通常處于靜息狀態，可通過吞噬作用清除細胞碎片從而維持腦內環境穩態[2]。但當大腦發生創傷、炎癥或感染時，小膠質細胞被激活，激活的小膠質細胞可分為經典(M1)表型和選擇性激活(M2)表型[3]。其中M1表型的小膠質細胞可由內毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導得到，其通常表現為胞體膨大，分枝縮短，呈阿米巴樣形態[4]，可通過分泌神經毒性物質(如ROS)和炎癥細胞因子(如IL-1β、TNF-α等)產生細胞毒性作用[5-6]。已有研究證明，經典激活的小膠質細胞在神經炎癥疾病中扮演著重要角色[7]，故抑制小膠質細胞的M1型激活可成為治療中樞神經系統炎癥的重要途徑。

馬錢子苷(loganin)屬環烯醚萜苷類化合物，為中國傳統中藥山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)的重要指標性成分，現已有研究發現其具有良好的抗炎、抗免疫及神經保護作用[8]。基于此，本研究以LPS刺激原代培養的小膠質細胞誘導炎癥反應，探討馬錢子苷對小膠質細胞活化的影響及其分子機制，為馬錢子苷應用于神經炎癥的預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad);Centrifuge 5810 R冷凍離心機(德國Eppendorf)；CO2培養箱(美國Thermo Fisher)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus BX51)。

1.2 實驗試劑

馬錢子苷(成都埃爾法生物科技有限公司)；LPS(美國 Sigma)；4%多聚甲醛固定液、引物(四川生工生物有限公司)；小鼠抗Iba1抗體、兔抗iNOS抗體、兔抗CD68抗體、兔抗NF-κB抗體(英國 Abcam)；Alexa Fluor 594 Conjugate山羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 Conjugate山羊抗兔(美國Cell Signaling Technology)；無菌PBS緩沖液、DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；Myco-3(德國Applichem)；胰蛋白酶、DMEM培養基、10%胎牛血清(美國 Gibco)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 實驗材料

C57BL/6J小鼠3只，出生2 d，雌雄不限，購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，動物質量合格證號SCXK(湘)2019-0014。

2 實驗方法

2.1 原代小膠質細胞培養

C57BL/6J小鼠3只，出生2 d，脫臼處死，75%乙醇消毒3～5 s，取出全腦放入無菌PBS緩沖液中洗凈表面血跡，移除小腦，剝離腦膜。吹吸粉碎大腦組織后600 r/min離心3 min，保留沉淀。0.125%胰蛋白酶37 ℃消化3～5 min，加入內含10%胎牛血清的DMEM完全培養基終止消化。使用70 μmol/L細胞篩過濾細胞懸液，離心，取底部沉淀即為細胞，加入小膠質細胞培養基(45 mL DMEM、5 mL PBS、100 μL青鏈霉素混合液、500 μL Myco-3)10～15 mL，移液槍吹打分散。將細胞懸液打入細胞培養瓶中，放入培養箱孵育，24 h后更換培養基，之后每3 d更換一次培養基，至細胞培養10 d左右后，用震蕩分離法分離純化即得原代小膠質細胞，將小膠質細胞以5×105的比例接種于24孔板中用于后續實驗。

2.2 藥物處理

將分離純化得到的小膠質細胞接種于24孔板中，放入37℃，5% CO2的培養箱中培養。細胞分為4個組，分別為空白對照組、模型組和不同濃度的馬錢子苷處理組(50、100、200 μmol/L)，每組3個復孔。空白對照組不做特殊處理，模型組每孔加入10 μL LPS(10 μg/mL)，給藥組分別加入不同濃度馬錢子苷，放入培養箱15～30 min后取出，除空白對照組外每孔加入LPS 10 μL，于CO2培養箱中培養24 h后進行后續檢測。

2.3 免疫細胞染色及熒光成像

2.4 定量PCR檢測炎癥因子表達

藥物處理24 h后，吸棄培養基，用PBS洗滌1遍，每孔加入1 mL Trizol裂解液，室溫放置5 min提取細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書進行純化及反轉錄，得到cDNA。采用定量PCR技術，在擴增曲線的線性階段測定每個反應的閾值擴增循環數(Ct)。每管反應混合物包括1 μL模板cDNA、5 μL MasterMix和1 μL引物，加入DEPC水，總體系為10 μL，瞬離后放入CFX96實時熒光定量PCR儀，在98 ℃預變性2 s，70 ℃退火5 s，并延伸，該過程重復35個循環，每個樣品3個重復。內參基因為β-actin，相關基因的表達按照2-ΔΔct的方法計算。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.5 酶聯免疫吸附測定(ELISA)

藥物處理24 h后離心收集細胞上清液。按照BCA蛋白測定試劑盒說明書進行操作，得到標準曲線后，計算樣品的總蛋白濃度，將樣品稀釋到相同濃度后嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定TNF-α、IL-1β蛋白質表達水平。

2.6 數據統計及顯著性分析

3 結果與分析

3.1 小膠質細胞分離純化

混合小膠質細胞體外分離培養1～3 d時，可見懸浮于培養基中的圓形小膠質細胞及貼壁生長的片狀、條狀星形膠質細胞(如圖1A～1C所示)；4～5 d時，懸浮的小膠質細胞數量增多，底部星形膠質細胞呈片狀鋪滿(如圖1D、1E所示)；6～8 d小膠質細胞數量逐漸增多至峰值，底部星形膠質細胞呈片狀鋪滿(如圖1F～1H所示)。混合培養一周左右，當上層懸浮的小膠質細胞生長到對數期時(大多數小膠質細胞還未長出分枝之前)，從混合膠質細胞中將小膠質細胞分離純化。剛分離純化后的小膠質細胞在顯微鏡下觀察呈圓形(如圖1I所示)，于體外培養1～2 d可見其形態不規則，呈短棒狀，有突起伸出(如圖1J、1K所示)。用細胞純度檢測方法：(IBA1標記的細胞數量/DAPI細胞數量)×100%，結果顯示細胞純度達到99.3%以上，可用于后續研究。

注：圖A～H分別為分離培養1、2、3、4、5、6、7、8 d的混合膠質細胞；圖I為從混合膠質細胞中剛純化得到的小膠質細胞；圖J為純化得到的小膠質細胞在體外培養1 d的形態圖；圖K為純化得到的小膠質細胞在體外培養2 d的形態圖；圖L為小膠質細胞免疫熒光染色圖，IBA1標記小膠質細胞(紅色)，DAPI標記細胞核(藍色)。圖1 原代小膠質細胞分離純化培養Fig.1 Isolation,purification,and culture of primary microglia

3.2 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞形態的影響

免疫細胞化學染色結果顯示，與對照組相比，LPS處理組小膠質細胞可觀察到呈現阿米巴樣巨噬細胞形態，表明LPS能夠成功誘導小膠質細胞向M1表型激活。且LPS處理后小膠質細胞胞體膨大，細胞核面積顯著增加(P<0.005)。用3個不同濃度的馬錢子苷干預后，均能顯著減少小膠質細胞的細胞總面積和細胞核面積(P<0.001)(圖2)。

注：IBA1(紅色)標記小膠質細胞，DAPI(藍色)標記細胞核，Merge表示三色疊加。圖2 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞形態的影響Fig.2 Effects of loganin on LPS-activated microglia morphology

3.3 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞炎癥因子mRNA表達的影響

定量PCR結果顯示，與空白組相比，LPS組小膠質細胞所分泌的促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表達明顯升高(P<0.05)，表明此時的小膠質細胞由靜息狀態向M1型活化。與LPS組相比，50 μmol/L的馬錢子苷預處理組TNF-α、IL-6的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，IL-1β表達水平雖有下降但無統計學差異(P>0.05)，而100 μmol/L與200 μmol/L的馬錢子苷干預組TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)(如圖3所示)。

圖3 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞炎癥因子mRNA表達的影響Fig.3 Effects of loganin on the expression of inflammatory cytokine mRNAs in LPS-activated microglia

3.4 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞iNOS蛋白表達的影響

誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可催化生成一氧化氮(NO)從而參與炎癥和腫瘤形成，本研究通過檢測iNOS的蛋白表達量從而反映細胞發生炎性活化的程度。免疫細胞化學染色結果顯示，與對照組相比，LPS組小膠質細胞綠色熒光增強，陽性染色面積更大，表示細胞被激活且細胞內有iNOS蛋白表達(圖4B1～B4)。與LPS模型組相比，50、100、200 μmol/L的馬錢子苷干預組均可見綠色熒光強度及染色面積都有一定程度的降低，細胞質內iNOS蛋白表達下降，表示細胞被激活但是激活程度有所降低(如圖4 C1～ E4所示)。

注：iNOS(綠色)標記胞內iNOS蛋白，IBA1(紅色)標記小膠質細胞，DAPI(藍色)標記細胞核，Merge表示三色疊加。圖4 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞iNOS蛋白表達的影響Fig.4 Effects of loganin on iNOS protein expression in LPS-activated microglia

3.5 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞炎癥因子蛋白質含量的影響

ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)結果顯示，與對照組相比，LPS組細胞培養上清液中IL-1β、TNF-α的蛋白質含量顯著增加(P<0.001)；與LPS處理組相比，100 mmol/L馬錢子苷干預組細胞IL-1β、TNF-α的含量顯著減少(P<0.05)(圖5)。

圖5 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞炎癥因子蛋白質含量的影響Fig.5 Effects of loganin on the protein contents of inflammatory factors in LPS-activated microglia

3.6 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞的NF-κB信號通路的影響

NF-κB為一種重要的多向性細胞核轉錄因子，NF-κB被激活后進入細胞核內發揮其重要作用，并參與炎癥反應。本研究通過檢測NF-κB在小膠質細胞細胞核內的表達情況，反映小膠質細胞的炎性活化程度。免疫細胞化學染色結果顯示，與對照組相比，LPS組小膠質細胞綠色熒光更強(圖6 B1)，且胞體明顯膨大(圖6 B2)，表示NF-κB信號通路被激活。與LPS模型組相比，50 μmol/L、100 μmol/L馬錢子苷干預組細胞綠色熒光強度均有所降低(圖6 C1、D1)；在200 μmol/L馬錢子苷干預下細胞綠色熒光強度甚至消失(圖6 E1)，細胞核及總細胞面積均有所減少(圖6E2)。實驗結果表明低、中、高濃度的馬錢子苷干預能抑制LPS誘導的小膠質細胞NF-κB信號通路激活，從而抑制小膠質細胞向M1型極化。

注：NF-κB(綠色)標記胞內NF-kB蛋白，IBA1(紅色)標記小膠質細胞，DAPI(藍色)標記細胞核，Merge表示三色疊加。圖6 馬錢子苷干預對LPS激活的小膠質細胞的NF-kB信號通路的影響Fig.6 Effects of loganin on NF-κB signaling pathway of LPS-activated microglia

4 討論

小膠質細胞在大腦的發育、腦環境的維持和腦疾病監視中起著重要作用[9-10]，其能夠通過吞噬細胞碎片和蛋白聚集體維持中樞神經系統的穩定性[11]。正常情況下，小膠質細胞處于相對靜息狀態，但在遭受腦損傷后，小膠質細胞可以被激活為M1表型和M2表型[12]。其中M1表型小膠質細胞可產生促炎細胞因子(如TNF-α，IL-1β，IL-12)，并表達高水平的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)以促進NO的產生，這些炎癥介質的進一步積累可引起神經毒性，并損傷神經元[13]。小膠質細胞的活化狀態與腦內受損傷部位的嚴重程度密切相關，因此，尋找一種能夠抑制小膠質細胞M1型活化的藥物成為腦疾病治療的研究熱點。

LPS是一種已知的神經毒素[14]，可刺激小膠質細胞成M1表型并表達促炎細胞因子，誘導神經炎癥的發生，目前被作為神經退行性變的膠質細胞激活劑廣泛應用[15]。本研究利用LPS處理原代培養的小膠質細胞，并分別給予低、中、高濃度的馬錢子苷干預。結果顯示，LPS刺激的小膠質細胞胞體膨大、分支縮短，呈現出明顯活化的阿米巴樣形態。而用馬錢子苷干預后，小膠質細胞的細胞總面積及細胞核面積均顯著減少，幾乎恢復到與空白對照組相當的水平，并觀察到細胞呈現與空白對照組相似的分支形態。有研究發現，細胞肥大是其活化后蛋白表達增加的表現[16]。本研究也發現，LPS處理后，小膠質細胞分泌的促炎細胞因子量顯著增加，而3個不同濃度的馬錢子苷均可顯著下調LPS誘導的小膠質細胞TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達增加；中濃度的馬錢子苷能使LPS刺激的小膠質細胞分泌IL-1β、TNF-α的蛋白質含量顯著降低；3個不同濃度的馬錢子苷均能下調LPS誘導的小膠質細胞iNOS蛋白表達。

核轉錄因子-κB (NF-κB)是一種能控制DNA的轉錄、細胞因子合成的蛋白復合物，廣泛存在于神經元及膠質細胞中，能夠調節多種基因的表達并參與免疫反應[17]。iNOS是NF-κB信號轉導通路中的重要轉導分子，iNOS基因的部分啟動子序列能與NF-κB特異性結合，從而使NF-κB被激活并轉移至細胞核內，發揮轉錄因子的作用，編碼相應產物(如iNOS、TNF-α、IL-6等)[18]。因此，阻斷此通路對于活化小膠質細胞引起的神經炎性疾病的治療具有重要意義。本實驗進一步探索了馬錢子苷干預對小膠質細胞的NF-κB信號通路的影響，我們的研究發現，當LPS處理后iNOS蛋白表達量增加，這讓NF-κB的核轉移程度顯著升高，NF-κB信號通路被激活，細胞表現為M1型。但低、中、高劑量的馬錢子苷能抑制NF-κB的核轉移，從而抑制細胞向M1表型轉化。上述結果提示，馬錢子苷可抑制小膠質細胞的M1型活化，降低炎癥因子表達，其相關分子機制可能與抑制NF-κB信號通路激活有關。