酶標法測定人血清中HIV抗體的不確定度分析

石冬月 遼寧省撫順市望花區疾病預防控制中心 （遼寧 撫順 113001）

內容提要： 目的：探究分析酶標法測定人血清中HIV抗體的不確定度。方法：2019年8月～2019年12月根據JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》，采用酶標法測定人血清中HIV抗體，通過HIV抗體檢查結果，明確其不確定度，并進行詳細分析。結果：資料顯示，陰性B=0.28，陰性吸光度值=0.078，cutoff值=0.278。通過cutoff值可將說明書中的批內精密性原始值重新還原成吸光度值。結合微量加樣器校準證書可得出，75μ1的相對誤差是0.15%，可知不確定度=0.234μ1；結合75μ1微量加樣器在試驗期間核查的相關數據，可知不確定度=0.341μ1；結合檢驗規程的規定，每批次檢驗過程中樣品的加樣時間均小于30min，可知不確定度=8.66min；結合酶標儀鑒定證書，可知不確定度=0.01。最終可得，樣品的吸光度值和cutoff值比值B=4.332，不確定度U=1.2，k=2。結論：通過酶標法測定人血清中HIV抗體的不確定度，可減少假陰性出現幾率，可辨別檢測質量的影響因素，有利于實驗室檢測質量的提高。

隨著酶聯免疫法的飛速發展與在臨床的廣泛應用，酶標分析儀現今已經基本取代傳統的分光光度計，成為臨床檢測多種病毒、細菌的主要檢測手段[1]。臨床大量研究[2,3]指出，酶標法具有操作方便、檢測快速、結果準確等特點，可在各大醫院、疾控中心和血站等場所廣泛應用。現今，酶標法多用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病等病毒的檢測。不確定度是酶標法檢測過程中的一項重要指標，也是對檢測結果質量的定量表征，不確定度的大小在一定程度上影響到檢測結果的可信度大小。因此，在采用酶標法檢測人血清中HIV抗體的過程中，為保證檢測結果的準確性、可信度，必須檢測其不確定度[4]。基于此，本文簡單研究分析酶標法測定人血清中HIV抗體的不確定度。

1.資料與方法

1.1 樣品

本次研究所采用的樣品是模擬HIV抗原抗體陽性混合血清，由弱陽性HIV1型抗體血清+弱陽性HIVP24型抗體血清組合為混合血清。

1.2 試劑

本研究采用的試劑盒出自北京陸橋公司，是通過酶聯免疫法檢測的人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒。

1.3 儀器

本研究所用儀器是產自奧地利的ANTHOS READER 2010型酶標儀、5～50μ1可調移液器、青島海爾HR40-IIA2型生物安全柜。

1.4 檢測方法及過程

在板架上固定所需數量板條，并設置相應的空白對照孔（1孔），孔洞中不添加任何液體；設置陽性對照孔（2孔），在孔洞中添加50μ1陽性液體；設置陰性對照孔（3孔），在孔洞中添加50μ1陰性液體；在其他孔洞中各添加檢測樣品50μ1。然后將板條全部置入37°C環境下孵育30min，然后去除孔洞中的液體，將提前稀釋完畢的洗液注入各個孔洞，靜置60s后，摒棄孔洞中的液體，重復清洗6次后，將孔洞拍干，每孔添加50μ1底物緩沖液，然后再加入50μ1底物液，充分振蕩混勻后，然后將板條全部置入37°C環境下孵育30min，在每個孔洞中添加50μ1終止液，輕拍混勻后，通過全自動酶免分析儀自動讀數，分別讀取各個孔洞的OD值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析。

2.結果

2.1 測量的數學模型

結合本研究所采用的北京陸橋公司試劑盒說明書中的檢測結果計算、測定方法，建立相應的測量數學模型，B（樣品吸光度與cutoff值的比值）=S（檢測樣品的吸光度值）/cutoff值。其中cutoff值=N（陰性對照吸光度值均值）+0.200。由此可得，B=S/（N+0.200）。

2.2 不確定度來源分析

本研究在分析不確定度來源時，從多個方面進行考慮分析，如人員、設備、環境、材料、方法、被測量對象等，不可重復考慮，但也不能遺漏每一個對象。從檢測方法原理可看出，B的影響因素有：加樣時間、試劑盒批內精密性、加樣量、孵育溫度、孵育時間、洗板的清洗程度、酶標儀測量等。本次研究嚴格控制孵育時間、加樣時間、孵育溫度、加樣量、洗板的清洗程度等。從研究結果可看出，以上因素對酶標儀的檢測結果影響不大。所以無需考慮引入不確定度。

2.3 評定測量不確定度分量

在評定分析試劑孔的吸光度不確定度時，檢測樣品吸光度值的不確定度可根據試劑盒批內精密性資料分析，批內精密性可根據實驗室試驗、說明書、試劑檢測報告等方式獲取。本研究通過酶聯免疫法試劑盒說明書所提供的資料對不確定度進行評定分析，資料顯示，陰性B=0.28，陰性吸光度值=0.078，cutoff值=0.278。通過cutoff值可將說明書中的批內精密性原始值重新還原成吸光度值。詳情見表1。結合微量加樣器校準證書可得出，75μ1的相對誤差是0.15%，可知不確定度=0.234μ1；結合75μ1微量加樣器在試驗期間核查的相關數據，可知不確定度=0.341μ1；結合檢驗規程的規定，每批次檢驗過程中樣品的加樣時間均小于30min，可知不確定度=8.66min；結合酶標儀鑒定證書，可知不確定度=0.01。最終可得，樣品的吸光度值和cutoff值比值B=4.332，不確定度U=1.2，k=2。

表1. 批內精密性

3.討論

現今，酶聯免疫吸附試驗在人體血清HIV抗原抗體檢測中的應用，在各個醫療機構、檢驗檢疫機構、疾病預防控制機構、采血機構等得到了廣泛普及。可根據檢測結果對HIV感染者進行判定診斷，將實驗室檢測結果作為診斷依據。而從酶標法檢測人體血清HIV抗體的檢測結果報告中可以看出，陽性、陰性的判定是根據臨界值、檢測值的大小進行判斷的。當檢測值與臨界值的數值十分接近時，若不及時考慮不確定度的存在與影響，則會對檢測結果的判定造成一定的偏差，有一定幾率會把弱陽性標本當成陰性標本。這樣既會影響檢測報告結果的準確性，又會因漏診而延誤患者的治療，導致病情迅速發展，還會因未及時進行有效隔離與防護，進一步危害社會公共衛生安全。因此，在酶聯免疫吸附試驗過程中添加不確定度是非常有必要的，可提高檢測試驗結果的準確性與科學性。

由上可知，通過酶標法測定人血清中HIV抗體的不確定度，可減少假陰性出現幾率，可辨別檢測質量的影響因素，有利于實驗室檢測質量的提高。