葉綠素銅鈉鹽的研究進展

楊馥毓，丁小強，田 芳，方 舟，羅舜菁，劉成梅，熊 勇,*

1.南昌大學 食品學院 (南昌 330047)2.江西丹霞生物科技股份有限公司 (鷹潭 335200)

葉綠素是一種安全且具有一定生理功能的天然色素。現代研究發現，葉綠素不僅可以在食品或化妝品中用作天然著色劑，而且還有重要的生理活性，如抗致突變、降解膽固醇和改善便秘等作用[1]。除此之外，由于葉綠素的分子結構和人體血紅蛋白的分子結構極其相似，區別僅在于兩者的中心離子不同，所以，葉綠素也被應用于治療貧血癥[2]；另外，葉綠素也能夠提高正常紅細胞的生長，增加機體含氧量，促進細胞分裂，從而有助于人體的新陳代謝[3]。但是，葉綠素不溶于水，在光照和一定的溫度條件下極易發生分解，從而其應用受到局限。研究表明，通過使用銅、鐵、鋅等金屬離子置換葉綠素中心鎂離子生成的產物比葉綠素的穩定性和水溶性更強，而且仍具有與葉綠素類似的色澤和生理功能，因此有大量關于葉綠素衍生物的相關研究，其中采用銅離子置換鎂離子生成葉綠素銅鈉鹽是最廣泛采用的方法[2]。

本文概述了葉綠素銅鈉鹽的結構和性質，重點總結了葉綠素銅鈉鹽的制備工藝，并提出了其中存在的問題與可能的改進方法，為其進一步研究和相關產品的開發提供理論依據。

1 葉綠素銅鈉鹽的結構和性質

1.1 葉綠素銅鈉鹽的結構

葉綠素銅鈉鹽的分子式為C34H31O6N4CuNa3和C34H30O5N4CuNa2，相對分子質量約為724.17和684.16。葉綠素銅鈉鹽是利用葉綠素為基礎通過一系列反應制備而成的產物。葉綠素是包含四個吡咯環，相互之間以甲烯基(=C-)聯結，從而形成穩定的共軛體系，共軛體系中心結合著一個鎂離子，在共軛體系的側鏈上連接著兩個酯化的羧基基團，分別是與甲醇、植醇所酯化[4]。葉綠素銅鈉鹽是在葉綠素的基礎上，發生皂化反應脫去植醇和甲醇，且在酸性條件下，Cu2+取代Mg2+而生成的產物，葉綠素及葉綠素銅鈉鹽的分子結構如圖1所示。

1.2 葉綠素銅鈉鹽的性質

葉綠素銅鈉鹽易溶于水，微溶于醇類，不溶于油脂和石油醚。其色澤為墨綠色，狀態為粉末狀。其水溶液為透明的藍綠色。若有Ca2+存在，則有沉淀析出。通過紫外可見光譜掃描可知，在405 nm±3 nm和630 nm±3 nm的兩個波長范圍內均有最大吸收峰。

2 葉綠素銅鈉鹽的功能應用

2.1 食品應用

葉綠素銅鈉鹽被批準可在果凍、蔬菜罐頭、糖果、飲料、果蔬汁類飲料、焙烤食品、配制酒、等產品中使用[5]。

2.2 醫療應用

通過研究發現葉綠素銅鈉鹽有保護和促進肝臟的功效，還能夠治療黃疸等疾病[6]；而且葉綠素銅鈉鹽能夠增強造血功能，促進血紅蛋白的生成，治療貧血等癥狀[7]；葉綠素銅鈉鹽具有調節口腔微生物，防治蛀牙、牙周炎，消除口腔和呼吸道異味的作用[8]。另外，葉綠素銅鈉鹽還被用于濕疹、凍瘡、急性胰腺炎等病癥的治療[9]。

2.3 染色應用

葉綠素銅鈉鹽能夠用于染色，是一種環保、節能的染料。利用其進行染色，不但能夠充分利用生物質資源，還符合當前人們追求生態環保的理念。王娜，楊瑞玲等[10-11]通過研究發現，葉綠素銅鈉鹽染料適合在酸性條件下染羊毛、蠶絲和錦綸，這些材質經過葉綠素銅鈉鹽染色之后的色牢度也可以達到3級以上。

2.4 其他應用

Ruan[12]通過研究發現，以葉綠素銅鈉鹽為電極的全固態超級電容器具有良好的彎曲能力和柔韌性。這也表明葉綠素銅鈉鹽在全固態超級電容器方面具有潛在的應用。

3 葉綠素銅鈉鹽的制備工藝研究

葉綠素銅鈉鹽的制備包括：葉綠素的提取，利用葉綠素制備葉綠素銅鈉鹽。

3.1 葉綠素提取

研究表明，提取葉綠素的方法主要包括溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等方法[13]。其中最常用的方法是溶劑提取法。該方法是依據相似相溶的原理，提取溶劑和被提取物質的化學性質越相似，被提取物在溶劑中的溶解能力就越大，就越容易被提取出來。葉綠素含有一個親水性的卟啉基團和一個親脂性的葉綠醇的結構[13]。親脂性的葉綠醇具有20個碳原子，較長的碳鏈決定了其極性較小，親脂性較強而親水性較弱，相反親水性的卟啉結構增強了其極性。因此，提取葉綠素最佳的溶劑是中等極性的有機溶劑，例如丙酮、乙醇、乙醚等。常見的溶劑的極性如下表1所示。

表1 某些溶劑的介電常數

楊軍[14]通過實驗對比了100%無水乙醇、100%丙酮等十幾種溶劑對葉綠素提取率的影響，結果為質量分數為85%的丙酮-無水乙醇(1∶2，v/v)復配為最佳提取溶劑。復配的溶劑比單一溶劑的提取效果更好，可以認為是一種協同萃取效應，也可以認為復配溶劑的性質與被提取物更加相似，因而提取率更高。雖然采用丙酮與其他溶劑的復配液具有較高的葉綠素提取率。但是，丙酮的閃點低、易爆、揮發性較強，在大規模的工業化使用中具有一定的危險性。因此采用安全性高、低毒的試劑替代丙酮作為葉綠素的提取溶劑是必要的。乙醇揮發性低、毒性低且安全性高，而且對于葉綠素有較高的提取率，因此成為工業化提取葉綠素的最佳試劑。

葉綠素位于葉綠體片層的蛋白質和脂脂中間，其中親水性的卟啉基團連接蛋白質，親脂性的葉綠醇連接脂質層。提取葉綠素時適當加入少量的水有利于葉綠素親水性基團和蛋白質的分離，從而促進葉綠素的提取。房家詳[15]通過研究發現，乙醇與水濃度比為4∶1時，葉綠素的提取率最大——12.8 g/kg，使用100%乙醇提取葉綠素時，提取率反而減少。

超臨界流體萃取技術作為新型分離技術，其操作溫度低、分離效率高且溶劑回收率高，近年來開始應用于植物和中草藥有效成分的提取。Lefebvre[16]通過研究發現，通過超臨界流體萃取的方法，在二氧化碳中添加30%的極性改性劑能夠獲得葉綠素。

超聲輔助萃取技術也經常被應用于分離提取中，超聲波的振動空化作用能夠促進細胞的裂解，從而有利于溶劑的提取，Choi[17]通過研究表明，利用超聲波輔助提取葉綠素的提取率比有機溶劑提取法更高。

3.2 葉綠素銅鈉鹽的制備

葉綠素銅鈉鹽的制備，包括皂化、酸化、銅代以及成鹽四個反應步驟。另外，由于原料中的葉綠素含量極少，提取之后會含有很多雜質，因此除了這些必要的反應步驟還會加入純化除雜的步驟。事實上，現有的工藝存在一定的弊端，例如皂化不完全、銅代“失綠”，以及純化效果差、產品質量低等，因此有待進一步改進。

3.2.1葉綠素銅鈉鹽制備原理

(1)皂化

葉綠素分子上的兩個酯基和氫氧化鈉發生皂化反應，脫去植醇和甲醇，生成水溶性的葉綠素鈉鹽(以葉綠素a為例，見圖2)。

圖2 皂化反應的反應方程式

(2)酸化

在酸性環境中，氫離子取代葉綠素鈉鹽中的鎂離子和鈉離子，生成葉綠酸及硫酸鎂和硫酸鈉(見圖3)。

圖3 酸化反應的反應方程式

(3)銅代

在酸性介質中，加入一定量的CuSO4溶液，葉綠酸分子中的氫離子會被銅離子取代生成墨綠色的葉綠素銅酸(見圖4)。

圖4 銅代反應的反應方程式

(4)成鹽

將葉綠素銅酸溶解，與氫氧化鈉溶液反應，可得到水溶性葉綠素銅鈉鹽(見圖5)。

圖5 成鹽反應的反應方程式

3.2.2制備工藝存在的問題及改進

葉綠素的皂化程度不僅會影響銅代反應的進行，而且也會影響葉綠素銅鈉鹽的產量、色澤和質地。有研究通過探究pH值對皂化反應的影響，得出pH=11或12時是最佳皂化條件[3, 18-21]。但是目前市場上大多數pH計和pH試紙只適合在水溶液中使用，而葉綠素的提取溶劑為高濃度的乙醇、丙酮等有機試劑，在此條件下測得pH值存在一定的偏差且不穩定。因此皂化反應要根據NaOH的實際添加量進行探究，而不能僅依據pH值。葉綠素為脂溶性物質，皂化前可以溶解于石油醚，皂化后生成水溶性的葉綠素鈉鹽不溶于石油醚，因此，皂化反應之后在其中加入石油醚進行萃取，通過分層情況與石油醚層狀態也可以預判皂化反應是否完全。萃取相和萃余相兩相分層清晰且石油醚層呈黃色可判斷反應較完全[21]。

對葉綠素銅鈉鹽進行酸化銅代時，很多研究在葉綠素鈉鹽水溶液中加入一定濃度的硫酸溶液從而將pH調到2.5左右，反應一定的時間后加入硫酸銅溶液[22-24]。事實上，直接將pH調為2.5可能會破壞葉綠素鈉鹽的卟啉結構，從而使得生成的葉綠素銅酸失綠，進而影響葉綠素銅鈉鹽的品質。酸化目的是為了更好、更方便地進行銅代，同時酸化也是為了避免硫酸銅與氫氧化鈉發生反應，生成氫氧化銅等其他物質。因此，酸化銅代時先將pH調為中性，加入適量硫酸銅進行反應，然后再將溶液調為2.5，這樣能夠避免太強的酸性環境可能會造成葉綠素鈉鹽中卟啉結構的破壞。

由于葉綠素在原料中含量極少，提取之后的雜質相對較多，因此純化步驟是必要的。在葉綠素銅鈉鹽的制備過程中，皂化反應生成葉綠素鈉鹽后加入石油醚進行溶劑萃取，目的是除去脂肪、胡蘿卜素、葉黃素和植物醇等脂溶性物質，是為了獲得較高的產品品質[25]。溶劑萃取時，各成分在兩相溶劑中分配系數相差越大，其分離效果越好，雜質去除率越高。傳統工藝是在乙醇中進行皂化反應生成葉綠素鈉鹽，再利用石油醚萃取除雜。事實上，利用乙醇-石油醚兩相進行溶劑萃取的效果較差，這是因為部分親脂性雜質在乙醇中的溶解度也較大，從而使得除雜效果不理想。如果將乙醇回收，葉綠素鈉鹽只是溶于水，水與石油醚的極性相差較大，從而能夠獲得更好的除雜效果。除此之外，單一溶劑進行多次萃取只能除去少量在該溶劑中溶解度較高的雜質。而采用不同極性的多種試劑進行萃取能夠將多種雜質萃取分離出來，從而增強其除雜效果。因此選用3～4種不同極性溶劑如乙酸乙酯、丁醇、氯仿、石油醚進行溶劑萃取，由低極性到高極性將葉綠素鈉鹽水溶液分步進行萃取，除去極性不同的雜質。

除此之外，在銅代反應生成葉綠素銅酸后使用水、低濃度醇、石油醚等進行洗滌除雜，使用水洗滌能夠除去過量的鈉離子、銅離子等水溶性雜質，使用低濃度醇洗滌能夠去除未被皂化的極性物質，使用石油醚洗滌除去脂溶性雜質，最終將葉綠素銅酸粗品洗滌成墨綠色帶有金屬光澤疏松顆粒狀精品。這些步驟也是為了純化除雜，獲得較高的產品品質。

4 總結與展望

當前，由于食品安全意識的增強，許多合成色素被禁止使用，安全、天然的產品更加受到人們的青睞，從而為天然色素市場開發提供了良好機遇，天然食用色素逐漸成為朝陽產業。葉綠素銅鈉鹽作為安全的天然色素，不僅可以作為著色劑添加到食品中，而且在醫藥方面具有良好的效果與應用。但是由于原料中的葉綠素含量很低，提取之后有較多的雜質，再加上現有制備工藝中存在一定的缺陷，從而導致市場上售賣的葉綠素銅鈉鹽產品大多品質較低，因此亟需從不同角度入手改善葉綠素銅鈉鹽的制備工藝和提純方法。