QuEChERS-液質聯用技術同時測定大米中的4種真菌毒素及5種農藥殘留量方法的研究

蔣林惠，陳 彬，周易枚，楊 俊，周 楠，陳 煜

南通市食品藥品監督檢驗中心 (南通 226000)

我國大米中真菌毒素和農藥殘留量的情況一直以來都受到多方面的關注，日常監督檢驗過程中這兩類污染物時有檢出[1-2]，因此監測大米是否受到真菌毒素和農藥殘留的污染，對于保證大米的質量安全具有非常積極的意義。

真菌毒素目前的國標檢測方法主要有：液相色譜串聯質譜法、液相色譜法、酶聯免疫吸附法、薄層色譜法等。農藥殘留量的國標檢測方法有氣相色譜法、氣質聯用法、液相色譜法、液質聯用法等[3]。目前，我國現行的真菌毒素及農藥殘留量的相關檢測標準僅單獨測定其中一類污染物，未有真菌毒素和農藥殘留同時檢測的標準。為此，建立一種適用于大米等糧谷中多種真菌毒素和農藥殘留量同時檢測的方法，對于在實際檢測中提高效率、節約成本十分重要。本文基于QuEChERS前處理技術，根據實驗材料及目標化合物進行方法改進，建立一種液質聯用技術同時測定大米中4種真菌毒素和5種農藥殘留量的高通量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大米：購自農貿市場。

主要儀器：Thermo Vanquish-TSQ Altis型液質聯用儀，賽默飛世爾科技；Milli-QReference型超純水器，密理博上海公司；氮吹儀，biotage/瑞典；電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技；研磨機，IKA。

主要試劑：甲醇(默克，色譜純)、乙腈(默克，色譜純)、甲酸(阿拉丁，色譜純)、乙酸銨(國藥，色譜純)，無水硫酸鎂(安譜，>98%)，氯化鈉(安譜，優級純)，C18(安譜)。

標準物質：吡蟲啉(BePure，1 000 μg/mL)、阿維菌素(BePure，1 000 μg/mL)、嘧菌酯(BePure，998.2 μg/mL)、戊唑醇(BePure，998.7 μg/mL)、肟菌酯(BePure，999.7 μg/mL)、黃曲霉毒素B1(First Standard，100 μg/mL)、13C17黃曲霉毒素B1(Romer，0.5 μg/mL)、T-2毒素(First Standard，100 μg/mL)、玉米赤霉烯酮(安譜，50 μg/mL)、赭曲霉毒素A(First Standard，10 μg/mL)，以上標準物質均為溶液型。

1.2 標準溶液的配制

購入的標準儲備液，用甲醇∶乙腈(1∶1，v/v)稀釋并配制中間濃度的標準工作液1 μg/mL(其中玉米赤霉烯酮為10 μg/mL)，于4 ℃下避光保存。根據需要用基質提取液逐級稀釋，配制成適當濃度的混合標準工作液，現配現用。

1.3 方法

1.3.1樣品前處理方法

樣品粉碎后過20目篩，準確稱取粉碎均勻的樣品粉末5.00 g(精確到0.01 g)，置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈-水-甲酸(84∶15∶1，v/v/v)，渦旋振蕩3 min，超聲20 min，浸泡過夜(-18 ℃)；加入4 g無水MgSO4，1 g NaCl，渦旋2 min，10 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液，加入100 mg C18，渦旋2 min，-18 ℃冷凍2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，經40 ℃氮吹濃縮近干，加入初始流動相1 mL復溶，渦旋1 min，上清液過0.22 μm濾膜，LC-MS/MS測定。

1.3.2檢測條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱，Accucore Aq，150 mm×2.1 mm，2.6 μm；流動相，A為5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水，B為甲醇乙腈(甲醇∶乙腈=1∶1，v/v)，梯度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積2 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫比例

1.3.2.2 質譜條件

離子源，電噴霧離子源(ESI)；掃描方式，正離子模式；掃描模式，SRM多反應監測掃描；離子源電壓3 500 V；離子傳輸管溫度300 ℃；蒸發溫度400 ℃；鞘氣35(Arb)；輔助氣8(Arb)；反吹氣0(Arb)。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

測定真菌毒素和農藥殘留，流動相通常由水和有機溶劑(如甲醇、乙腈)等組成[4]，流動相的選擇關系到樣品的分離度和離子化效果，也會對化合物在質譜檢測的信號響應值產生影響[5]。

為提高藥物目標化合物的電離度，得到更好的靈敏度[6]，試驗對比了5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水-甲醇乙腈溶液(其中甲醇∶乙腈=1∶1，v/v)、5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水-甲醇溶液、5 mmol乙酸銨0.1%甲酸水-乙腈溶液、甲醇-水、乙腈-水5套體系，流動相選擇梯度洗脫，調節有機相比例使液相條件最佳。結果表明，流動相中加入0.1%甲酸及5 mmol乙酸銨能有效促進目標物的電離，并且有利于改善目標物的峰形。而甲醇-水、乙腈-水作為流動相時，赭曲霉毒素A的峰形展寬；而加入甲酸的流動相，9種污染物均能得到較好的峰形[2]。另外，乙腈甲醇(1∶1)的有機相使得真菌毒素的分離和峰形效果較好。另外，根據色譜柱的柱長、內徑、填料粒徑，本實驗選擇0.3 mL/min的流速。

2.2 質譜條件的選擇

本實驗測定的9種物質(包含黃曲霉毒素內標)，根據其化學性質，均采用ESI+模式進行掃描。應用儀器自帶的工作站TSQ自動優化質譜參數，首先采用母離子掃描模式，根據質荷比確定母離子設置合適的離子源電壓，離子傳輸管溫度，蒸發溫度，鞘氣、輔助氣、反吹氣的氣流量，確保每個物質都能獲得較好的相應。再進行SRM優化，優化子離子、碰撞能量、透鏡電壓。定量離子、定性離子的選擇參照相關標準。最終建立10種物質的多反應檢測掃描(SRM)方法。本實驗中涉及的化合物的SRM詳細信息見表2。

表2 9種真菌毒素和農藥殘留質譜條件

2.3 樣品提取與凈化

大米粉的含水量較低，提取溶液需加入一定比例的水相以提高目標化合物的提取率[7]。乙腈對于農藥和真菌毒素均有良好的溶解性[5]，故選其作為提取液的有機相。提取液加入適量的甲酸，能夠有效提取對酸度和極性較為敏感的真菌毒素和農藥殘留物質[8]。

本實驗中考察提取液乙腈-水-甲酸(84∶15∶1，v/v/v)、乙腈-水(84∶16，v/v)兩種提取溶液對9種藥物的回收率和提取效果，并通過基質匹配的外標法進行計算(其中黃曲霉毒素B1選擇內標法進行定量計算)。

本實驗乙腈-水提取液進行提取時，赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的回收率較低，乙腈-水-甲酸提取液進行提取時，9種污染物的回收率能夠符合60%～120%的規定[9]。

鹽析劑的作用是促進水相和有機相的分層，使得待測物進入到有機相中，從而提高提取效率[10]。本實驗中采用經典的鹽析劑品種和配比：4 g無水MgSO4，1 g NaCl。而凈化過程是一個除去提取液中雜質并保證目標化合物回收率的一個過程。通常考慮采用C18、PSA進行待測溶液凈化。C18對長鏈脂類物質、甾醇等非極性的干擾物有良好的吸附效果，而PSA因其特殊結構易與酸性真菌毒素(如赭曲霉毒素A)分子上的羧基反應，影響其回收率。故在該實驗中選擇C18100 mg作為凈化試劑。

2.4 方法的線性范圍和定量限

本實驗選擇空白基質提取液匹配標準曲線進行定量，減小基質效應對于準確度的影響。用大米基質空白配制4種真菌毒素和5種農藥殘留的混合標液，質量濃度依次為10、20、50、100、150、200 μg/L；其中玉米赤霉烯酮為100、200、500、1 000、1 500、2 000 μg/L。結果表明，當質量濃度為10～200 μg/L(ZEN：100～2 000 μg/L)，9種藥物的回歸曲線的決定系數(R2)在0.995～0.999以上，線性關系良好。開展大米空白樣品添加試驗，以10倍信噪比時的添加濃度為方法定量限，結果如表3所示，9種藥物的定量限在5 μg/kg(AFT-B1可將定量限降低至0.1 μg/kg)，玉米赤霉烯酮50 μg/kg。

表3 9種真菌毒素及農藥殘留的線性及方法定量限

2.5 精密度和回收率

稱取不含9種真菌毒素和農藥殘留的大米樣品，添加混合標樣，添加濃度(質量分數)分別為10、50、100 μg/kg，每個水平做3次平行。結果顯示，9種藥物的平均回收率為62.8%～98.1%，精密度為2.3%～13.5%(表4)。

表4 9種真菌毒素及農藥殘留回收率及精密度 %

3 結論

通過本文的實驗研究，建立起基于QuEChERS-液質聯用檢測技術的大米中4種真菌毒素和5種農藥殘留的快速檢測方案。該方法高效、準確、集約，適用于大米中吡蟲啉、阿維菌素、嘧菌酯、戊唑醇、肟菌酯、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等9種藥物的定性定量快速檢測，能夠為大米中主要真菌毒素和農藥殘留的快速高通量篩查提供一定的技術支持。