知母皂苷B-Ⅱ通過調控LncRNA XLOC_032768減輕LPS誘導心肌細胞損傷

薛興翠， 孫軍奎， 賀連棟

(青海紅十字醫院全科醫學科，青海 西寧 810000)

急性心力衰竭是臨床常見的一種心血管疾病，其中感染性內毒素血癥是引發心力衰竭的重要原因之一，而感染性內毒素血癥與革蘭氏陰性菌有關，脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上的重要致病因素，可誘導心肌組織損傷從而引發心力衰竭[1-2]。天然植物提取物可能通過調控微小RNA(miRNA)表達從而減輕LPS誘導心肌細胞損傷，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在心肌細胞損傷中表達異常并可能作為治療的潛在靶點[3-4]。

知母為我國傳統中藥，知母皂苷B-Ⅱ(Timosaponin B-Ⅱ，TB-Ⅱ)是其主要活性成分，對異丙腎上腺素誘發的大鼠心肌梗死的心臟發揮保護作用[5]，但該成分對LPS誘導心肌細胞損傷的作用機制尚未闡明。長鏈非編碼RNAXLOC_032768(LncRNAXLOC_032768)在順鉑誘導的腎小管上皮細胞中表達水平降低，上調其表達可減輕腎小管上皮細胞炎癥反應及抑制細胞凋亡[6]，但它在知母皂苷B-Ⅱ影響LPS誘導心肌細胞損傷過程中的作用機制尚不明確。因此，本研究采用LPS誘導心肌細胞建立細胞損傷模型，探討知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞凋亡、炎癥、氧化應激的影響及對XLOC_032768的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 知母皂苷B-Ⅱ購自上海莼試生物技術有限公司(粉末狀，純度≥98%，溶于DMSO中，批號20171203)。大鼠心肌細胞H9C2購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；LPS購自北京寰宇集團有限公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國HyClone公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；GSH-Px、SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；si-NC、si-XLOC_032768轉染質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司；MDA檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；NO檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；TNF-α、PGE2檢測試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄與熒光定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 常規培養心肌細胞，取對數生長期者接種于96孔板(1×104個/孔)上，分別加入含1 mg/L LPS的培養基培養24 h[7]，作為模型組；分別加入10、50、100 μg/mL 知母皂苷B-Ⅱ與含1 mg/L LPS的培養基培養24 h[8]，作為低劑量組、中劑量組、高劑量組；將正常培養的細胞作為對照組。參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書，將si-NC、si-XLOC_032768轉移至心肌細胞，加入100 μg/mL知母皂苷B-Ⅱ與1 mg/L LPS的培養基培養24 h，分別作為高劑量+si-NC組、高劑量+si-XLOC_032768組。

1.2.2 細胞凋亡率檢測 分別取各組心肌細胞，加入預冷的PBS，4 ℃、3 000 r/min離心6 min，棄上清，向細胞沉淀中加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3 MDA水平及GSH-Px、SOD活性檢測 取各組心肌細胞，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平，再加入0.25%胰蛋白酶消化，反復凍融法裂解細胞，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法檢測GSH-Px的活性，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 NO、TNF-α、PGE2水平檢測 取各組心肌細胞，反復凍融法裂解細胞，采用硝酸還原法檢測NO水平，ELISA法檢測TNF-α、PGE2水平，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 細胞中XLOC_032768表達檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)法。取各組心肌細胞，通過Trizol法提取細胞中總RNA，Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度，XLOC_032768正向引物5′-CAAGGATTCT ACAGTCCAACAATTTC-3′，反向引物5′-CGATA CAAGTAATTTATTTCTAATTG-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。RT-qPCR反應體系為cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環40次。以GAPDH為內標，采用2-ΔΔCT法計算XLOC_032768相對表達。

1.2.6 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blot法，收集各組心肌細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每孔加樣40 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，在4 ℃下孵育24 h，在TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL化學發光劑，暗室內曝光顯影，通過Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組凋亡率及Bax、cleaved caspase-3表達升高(P<0.05)，Bcl-2表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量組凋亡率及Bax、cleaved caspase-3表達降低(P<0.05)，Bcl-2表達升高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞凋亡的影響(Ⅰ)

表1 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞凋亡的影響

2.2 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞氧化應激的影響 與對照組比較，模型組MDA水平升高(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量組MDA水平降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性升高(P<0.05)，見表2。

表2 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞氧化應激的影響

2.3 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞炎癥因子的影響 與對照組比較，模型組NO、TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組NO、TNF-α、PGE2水平降低(P<0.05)，見表3。

表3 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞炎癥因子水平的影響

2.4 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞中XLOC_032768表達的影響 與對照組比較，模型組XLOC_032768表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各劑量組XLOC_032768表達升高(P<0.05)，見表4。

表4 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞中XLOC_032768表達的影響

2.5 干擾XLOC_032768表達與知母皂苷B-Ⅱ聯合作用對LPS誘導心肌細胞凋亡的影響 與高劑量+si-NC組比較，高劑量+si-XLOC_032768組凋亡率及Bax、cleaved caspase-3表達升高(P<0.05)，Bcl-2表達降低(P<0.05)，見圖2、表5。

表5 干擾XLOC_032768表達與知母皂苷B-Ⅱ聯合作用對LPS誘導心肌細胞凋亡的影響

圖2 知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞凋亡的影響(Ⅱ)

2.6 干擾XLOC_032768表達與知母皂苷B-Ⅱ聯合作用對LPS誘導心肌細胞氧化應激及炎癥因子的影響 與高劑量+si-NC組比較，高劑量+si-XLOC_032768組MDA、NO、TNF-α、PGE2水平升高(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性降低(P<0.05)，見表6。

表6 干擾XLOC_032768表達與知母皂苷B-Ⅱ聯合作用對LPS誘導心肌細胞氧化應激及炎癥因子水平的影響

3 討論

心肌細胞凋亡與氧化應激、炎癥等密切相關，而心肌細胞凋亡可引發各種心血管疾病，因而抑制心肌細胞凋亡成為心血管疾病治療的重要環節，既往研究顯示中草藥具有抗腫瘤、抗氧化應激等作用，并可抑制心肌細胞凋亡從而抑制心血管疾病的發展[9-11]。但知母皂苷B-Ⅱ在心血管疾病治療中的作用機制尚未完全闡明。

知母皂苷B-Ⅱ可抑制氧-糖剝奪脊髓前角運動神經元瘤細胞凋亡從而對細胞發揮保護作用[12]。知母皂苷屬于百合科植物，其是知母干燥根莖的主要成分，知母皂苷B是其主要活性成分，其具有抑制氧自由基生成及修復神經元損傷等作用[13]。知母皂苷B-Ⅱ可用于缺血性腦卒中的防治，此外，其可通過上調IL-18基因表達從而抑制肺癌細胞增殖及遷移[14]。本研究結果顯示LPS誘導后心肌細胞凋亡率升高，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后凋亡率明顯降低，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低。研究表明細胞接受到凋亡信號時，Bcl-2的表達降低，Bax的表達升高可促進線粒體釋放細胞色素C而激活Caspase級聯反應(cleaved caspase-3)從而促進細胞凋亡[15]。本研究結果顯示LPS誘導心肌細胞中Bax、cleaved caspase-3的表達升高，Bcl-2的表達降低，不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后Bax、cleaved caspase-3的表達降低，Bcl-2的表達升高，證實知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導心肌細胞凋亡。心肌細胞氧化損傷可誘導心肌損傷，氧自由基可被抗氧化酶降解從而促使機體維持動態平衡狀態，GSH-Px、SOD屬于抗氧化酶，其活性降低可促使細胞發生氧化損傷，氧自由基生成過量可促使細胞膜發生脂質過氧化從而破壞細胞膜完整性，MDA屬于脂質過氧化的產物[16]。本研究結果顯示LPS處理后心肌細胞中MDA水平升高，GSH-Px、SOD的活性降低，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后MDA水平降低，GSH-Px、SOD的活性升高，提示知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導心肌細胞氧化應激，且呈劑量依賴性。炎癥因子NO、TNF-α、PGE2水平升高可加重心肌細胞炎癥損傷[17]。本研究結果顯示LPS處理后心肌細胞中NO、TNF-α、PGE2水平升高，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后NO、TNF-α、PGE2水平明顯降低，提示知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導心肌細胞炎癥反應，且呈劑量依賴性。

XLOC_032768表達下調可促進炎癥因子的分泌從而加重急性腎損傷[18]。本研究結果顯示LPS誘導心肌細胞中XLOC_032768的表達下調，而不同劑量的知母皂苷B-Ⅱ處理后XLOC_032768的表達升高，且隨著劑量的增加而升高，提示知母皂苷B-Ⅱ可能通過上調XLOC_032768的表達從而減輕LPS誘導心肌細胞損傷。為驗證知母皂苷B-Ⅱ是否可通過調控XLOC_032768的表達從而發揮作用。本研究將si-XLOC_032768與知母皂苷B-Ⅱ共同處理LPS誘導心肌細胞，結果顯示凋亡率升高，Bax、cleaved caspase-3的表達上調，Bcl-2的表達下調，MDA、NO、TNF-α、PGE2水平升高，GSH-Px、SOD的活性降低，提示干擾XLOC_032768表達可降低知母皂苷B-Ⅱ對LPS誘導心肌細胞凋亡、炎癥及氧化應激的抑制作用。

綜上所述，知母皂苷B-Ⅱ可抑制LPS誘導心肌細胞凋亡、氧化應激及炎癥反應，其作用機制可能與上調XLOC_032768的表達有關，XLOC_032768可能作為心血管疾病治療的潛在靶點，還可為進一步揭示知母皂苷B-Ⅱ抗心血管疾病的分子機制奠定實驗基礎。但關于其具體作用機制仍需進一步探究。