益氣活血方聯(lián)合奧沙利鉑對SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響

王麗敏， 江智慧， 張明遠， 白 雪， 楊 玉， 馬春艷

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

胃癌是發(fā)病率極高的消化道惡性腫瘤，奧沙利鉑及其他鉑類抗癌藥是治療胃癌的一線化療藥，但在化療過程中胃癌細胞對奧沙利鉑不敏感，是導致治療失敗的重要原因，因此聯(lián)用輔助藥物提高胃癌細胞對奧沙利鉑的敏感性是提高化療效果的有效方法[1-3]。氣虛血瘀是惡性腫瘤重要病理機制，也是影響腫瘤化療療效的癥結(jié)所在[4]，臨床上采用益氣活血中藥配合奧沙利鉑對胃癌患者進行治療，取得了較好的療效[5]，但對其作用機制缺乏有效的系統(tǒng)的研究。因此，本研究探討益氣活血中藥與奧沙利鉑合用后對胃癌SGC-7901細胞生長的抑制作用及機制，為其臨床廣泛合理應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物及細胞株 健康清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (黑)2013-001。人胃癌SGC-7901細胞株(中國科學院上海生科院細胞資源中心)。

1.2 試劑與藥物 奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號H20000337)。胰蛋白酶(上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司，批號25300-054)；小牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號TBD41HX)；Annexin V-FITC細胞凋亡及caspase-3、caspase-8活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為C1062、C1116、C1152)。益氣活血方組方藥材生黃芪30 g、黨參15 g、雞血藤30 g、白芍10 g，均購自佳木斯大學附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)佳木斯大學藥學院劉娟教授鑒定為正品，稱定質(zhì)量后加水沒過藥材表面，浸泡40 min，煎煮2次，濾過，濃縮至1 g/mL，4 ℃下冷藏保存。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 30只大鼠隨機分為2組，每組15只，益氣活血方組大鼠以10 mL/kg劑量灌胃，每天2次，連續(xù)7 d，對照組大鼠給予等體積蒸餾水。第7天給藥后1 h，大鼠在無菌條件下眼眶后靜脈叢采血，室溫靜置1 h后3 000 r/min離心15 min，取上清，56 ℃下滅活30 min，無菌操作臺上用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MTT比色法測定細胞增殖抑制率及藥物效應 取指數(shù)生長期的SGC-7901細胞，胰蛋白酶液消化后用RPMI 1640培養(yǎng)液配成1×105mL單細胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗設對照組(僅加大鼠空白血清)、奧沙利鉑組(質(zhì)量濃度分別為10、20、40 mg/L)、益氣活血方含藥血清+奧沙利鉑組，按含藥血清10%、20%的比例分別加入不同質(zhì)量濃度(0、10、20、40 mg/L)的奧沙利鉑，每組均設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)10 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶溶解后，用酶標儀于490 nm波長處測定各孔光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率，公式為抑制率=[(對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值]×100%。聯(lián)合用藥效應常用金正均Q值法評價，Q=EA+B/(EA+EB-EA·EB)，其中EA代表A藥單獨給藥時的抑制率，EB代表B藥單獨給藥時的抑制率，EA+B代表A、B兩藥合并給藥的抑制率，0.85≤Q≤1.15，表明兩藥合用效應為相加；Q>1.15，表明兩藥合用效應為協(xié)同；Q<0.85，表明兩藥合用效應為拮抗[6]。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 按Annexin V-FITC凋亡試劑盒的說明，收集各實驗組(10 mg/L奧沙利鉑組、10%含藥血清組、10%含藥血清+10 mg/L奧沙利鉑組)及對照組(僅加大鼠空白血清)作用48 h后的SGC-7901細胞約1×105個，重懸于195 μL 1×Binding Buffer中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 10 μL，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。

2.4 caspase-3、caspase-8活性檢測 將指數(shù)生長期SGC-7901細胞以每瓶1×106個密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，設對照組、10 mg/L奧沙利鉑組、10%含藥血清組、10%含藥血清+10 mg/L奧沙利鉑組，細胞貼壁后加入藥物，對照組僅加空白血清，孵育48 h后去除培養(yǎng)液，冷PBS洗滌1次，0.25%胰蛋白酶消化，600×g離心5 min，收集SGC-7901細胞，利用試劑盒及酶標儀檢測caspase-3、caspase-8活性。

3 結(jié)果

3.1 益氣活血方和奧沙利鉑單獨或聯(lián)合使用對SGC-7901細胞增殖的影響 表1顯示，不同質(zhì)量濃度(10、20、40 mg/L)奧沙利鉑與10%、20%含藥血清聯(lián)合使用時，均表現(xiàn)為協(xié)同作用(P<0.01)。

表1 奧沙利鉑單獨或與益氣活血方聯(lián)用對SGC-7901細胞增殖的抑制作用

3.2 益氣活血方聯(lián)合奧沙利鉑對SGC-7901細胞凋亡率的影響 圖1顯示，對照組細胞凋亡率為(2.67±0.68)%，單用20%含藥血清為(9.85±1.06)%，單用20 mg/L奧沙利鉑為(20.93±2.55)%，20%含藥血清與20 mg/L奧沙利鉑聯(lián)合用藥后提高至(37.79±3.47)%。

注：與對照組比較，**P<0.01；與益氣活血方含藥血清+奧沙利鉑組比較，## P<0.01。

3.3 益氣活血方聯(lián)合奧沙利鉑對caspase-3、caspase-8活性的影響 圖2顯示，對照組caspase-3、caspase-8的OD值分別為0.037±0.005、0.031±0.007，單用益氣活血方分別為0.191±0.012、0.165±0.008，單用奧沙利鉑分別為0.483±0.017、0.478±0.015，益氣活血方與奧沙利鉑聯(lián)合應用分別提高至0.776±0.019、0.722±0.011。

注：與對照組比較，**P<0.01；與益氣活血方含藥血清+奧沙利鉑組比較，## P<0.01。

4 討論

對于胃癌的治療，化療依然是主要治療措施，從臨床化療中的癥候分析看，化療更易耗傷人體陽氣，加重體內(nèi)“氣虛血瘀”的病理狀況，影響氣血流暢，降低化療療效[7]。益氣活血方中黃芪、黨參可補中益氣，雞血藤、白芍可活血化瘀。本研究中，益氣活血方與奧沙利鉑合用時Q>1.15，說明兩種藥物聯(lián)合應用呈現(xiàn)協(xié)同作用。

誘導腫瘤細胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要作用機制[8]。caspase家族廣泛存在于細胞中，在細胞凋亡的執(zhí)行階段起著至關重要的作用[9-10]。從本實驗結(jié)果可看出益氣活血方與奧沙利鉑聯(lián)合用藥比單用奧沙利鉑細胞凋亡率、caspase-3和caspase-8活性都明顯提高。提示益氣活血方增強奧沙利鉑對胃癌細胞的凋亡誘導作用與提高caspase活性有關。

總之，益氣活血方能增強奧沙利鉑對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制作用，提高caspase蛋白活性和促進細胞凋亡是益氣活血方與奧沙利鉑聯(lián)合用藥協(xié)同增效的主要機制。在臨床上聯(lián)合應用益氣活血方與奧沙利鉑治療胃癌，可能既降低化療藥物的使用劑量從而減輕化療藥物對患者的副作用，同時又能提高療效，具有較好的臨床應用前景，這對于用中藥提高臨床化療療效具有重要意義。