層析技術在血液制品分離純化中應用的探討

黃喜佳

【摘要】文章主要是分析了我國的血液制品現狀，在此基礎上講解了層析技術的原理和分類，最后探討了其在血液制品中的實際應用，望可以為有關人員提供到一定的參考和幫助。

【關鍵詞】層析技術;血液制品;分離

【中圖分類號】R945 【文獻標識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.211

前言

當前我國社會的多元化發展，使得以往采用單一低溫乙醇法所制造出來的血液制品已經無法滿足當前人們對產品質量的需求，層析技術能夠有效提高到血漿的利用率和質量，且有效解決成本，為此文章主要是對層析技術在血液制品分離中的實際應用情況展開了研究和探討。

1 血液制品現狀

血液制品是指血漿蛋白質組分、分離、純化或重組 DNA 的技術和血細胞，用于治療和預防的重大疾病，由于治療和預防的發展和應用，在過去的幾十年中血液制品用于治愈和控制疾病，隨著世界各國對疾病的深入研究和對血液制品的開發，目前按照對血液制品的不同作用可分為人血白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、特殊蛋白和纖維蛋白粘合劑五大類。其中，免疫球蛋白在全球市場占有率最高，占 43%。其他成分的市場份額為凝血因子 17%，白蛋白 13%，其他成分 27%;據文獻報道，我國白蛋白市場占有率為 75%，其次是免疫球蛋白（25%），其余為 5%。除市場供求關系外，造成上述產品市場占有率不同的另一個重要因素是分離技術。

2 層析技術的原理和分類

2.1 層析技術的原理

目前使用層析技術廣泛，俄羅斯植物 M..Tswett 在本世紀發現該技術表明該植物的葉片還含有其他葉綠素和生物學。化學有效的分離分析工具也含有生物學的生物學和其他學科，層析技術是由物理和化學性質的不同物質建立的技術，并且所有層析系統由兩個階段組成：一種是固定階段或固定物質或固定在固體物質中。另一個是除固定的物質外的其他物資，即其他是流動階段，即一種可以流動的物質，例如水和各種介質。當要分離的混合物通過溶劑（流動相）分離時，由于每個組分的物理和化學性質的差異，每種組分（吸附，溶解，結合等）的物理和化學性質的差異（吸附，溶解，結合等），兩種組分的依賴分布（含量比較）是不同的。當溶劑向前移動時，每個組分在兩個階段連續重新發布，與固定相的相互作用較弱相位，阻塞效果越小，移動相位運動的前向移動速度越快。相反，與固定相的相互作用強，則前向運動速度很慢。

2.2 分類

2.2.1 薄層層析

薄層層析（TLC）是一種簡單，快速和跟蹤的層析技術。一般而言，柱層析中使用的吸附劑在平坦表面（例如玻璃板）上鋪展以形成薄層。TLC 原理類似于柱層析技術。薄層層析（TLC）由于其高分辨率，致密色斑和肉眼可見的低濃度，逐漸替換 Pharmacopoeia 中的 PC。TLC的主要優點是經濟性和簡單性。這種方法的主要缺點是，盡管它可以滿足許多限制測試的要求，但可視測量的主體性強烈，此方法最多可以是半定量的。TLC 的極限試驗列在藥典的不同標題下。在極限測試中最常見的 TLC 方法是檢測兩個濃度水平的物質。稀釋溶液代表雜質的最大允許濃度。因此，不需要參考樣品。FairBloom（1984）審查了 TLC在藥房的應用技術和應用范圍。后者包括雜質檢測，藥物穩定性，制備分析，體液中的藥物，抗生素，天然產物，表面活性劑，化妝品，脂質，添加劑等。未知藥物的有效成分為毒或無標記的白色片劑，在一個完整的標準中，是完全不可能的，盡管 TLC 由于實驗條件的限制，提供了一個簡單快速的鑒別方法，TLC 提供了一個簡單快速的鑒別方法。DHONT報告說，校正后的 RF 值與實驗室的中間區域進行通信。只有兩種對照品可以進行具體的實驗，并且可以計算出校正因子的個數，因此該方法可以用于其他實驗室。比較實驗結果，與 Moffatt 等人的 794 薄層層析系統可以用來鑒別抗組織胺、磺胺等藥物。

2.2.2 高效薄層層析

高效薄層層析技術的定量分析可能比高效液相層析技術昂貴，但它具有操作簡單、進樣速度快等優點，使得對每個樣品的分析都非常經濟有效。1985 年國際會議指出，TLC 和 HPTLC 在準確度、通用性、精密度和靈敏度等方面與 GC 和 HPLC 相當或優于 GC 和 HPLC。例如，薄層層析技術和高效薄層層析技術可用于沙丁胺醇的藥代動力學研究，比氣相層析 - 質譜法測定更快。用于控制抗生素生產發酵過程的單一半自動 TLC 系統可提供與 8 個 HPLC 系統相同的數據量。RITHRC通過 HPTLC 審查了對體液中藥物及其代謝物的定量分析。液體萃取與薄層層析相結合，已用于藥物制劑和生物中的藥物的快速鑒定。在法定分析中，常規柱層析（使用玻璃柱）通常用作預處理純化操作（例如分光光度法）的另一種分析方法。對于痕量污染物的檢測和測定，GC 和HPLC 通常比其他方法更好。但是，如果這些化合物不能從柱中洗脫，GC 和 HPLC 不像 TLC 一樣好。因此，GC 或 HPLC 的選擇取決于分析化合物的物理化學性質，樣品的類型和所需的檢測濃度。

2.2.3 氣相層析

在藥物和溶劑中測定不同處方藥中藥物的含量，主要用 1-3mm 長的填充柱進行分析，分離出的化合物用火焰離子檢測器進行檢測，適用于多種藥物，包括抗剝落劑、抗強效劑、鎮痛劑、三環抗鍵合液、苯、中樞神經興奮劑、抗腫瘤藥、抗生素、利尿劑等。氣相層析技術作為檢測手段，與質譜法一樣，在其它技術中也能獲得定性和定量信息。該方法主要用于常規 GCS，其無法獲得足夠的揮發性分析，PGC 在藥物的階段非常有意義，并且已經應用于微生物和真菌鑒定，臨床分析（對于一些代謝反索賠 /MS），有毒藥物，藥物分析（如波巴酸鹽，嗎啡，硫化物，青霉素和頭部等）。

2.2.4 高效液相層析

高效液相層析是藥物分析中應用最廣泛的分析方法，該技術本身可以幫助實現自動化，最好的系列型號包括自動進樣、三元或四梯度溶劑系統、柱轉換裝置和二極管陣列或快速掃描檢測器、全電子計算機、計算專用的測量數據處理設備和打印報表。目前設計的結果在高效液相層析儀、專門用于藥品質量控制的高效液相層析儀、傅立葉變換紅外檢測與開發以及相應的數據庫使用設備，以及非常強大的分析工具。在許多高效液相層析應用中，不需要進一步純化樣品，而需要去除由于物理體積和化學行為（如蛋白質和脂質）而損壞層析柱的雜質。簡單溶液（如進樣）可直接進樣或稀釋至適合檢測器檢測范圍的濃度。糖漿也需要稀釋，片劑和膠囊需要在超聲波浴中加工，并過濾以去除異常物質。雖然乳膏和軟膏可以用保護柱直接注射，但最好事先分離親脂性物質。

3 血液制品分離技術背景

20 世紀 40 年代，血液制品首次用 COHN 低溫乙醇分離純化，這一純化技術的深遠影響是世界血漿蛋白大規模生產的基礎，但當前科學技術和社會多樣化的需求，只有原有的分離技術帶來的產品不能滿足社會的需要，所以用這項技術來分離純化血液制品，新技術已應用于血液制品的分離純化，如離心、酸沉淀、過濾、層析、超濾等。其中，層析技術的應用從根本上改變了原始技術的缺點，如長分離時間，分離效果不佳，產品類型少，自動化程度低，有效提高了原料血漿的利用率和安全性，并豐富了產品類型。據文獻報道，20 多種產品已從國外有效地分離出來，其中 10 個以上是在研發或臨床試驗的階段。但是，由于中國分離技術的延遲開始，雖然大多數企業在血液產品的分離和純化中也引入了層析技術，但大多數都還是處于一個實驗階段，并未正式應用在一些大型工業生產當中。目前我國的血液制品仍以低溫乙醇為主，產品僅限于血漿、免疫球蛋白、纖維蛋白原和凝血因子 VIII，如何通過層析分離，改變分離技術的技術分析，提高分離效果，增加血液分離成分是血液制品的研究重點，本文通過我國分析技術在血液制品分離純化中的應用，并結合實際血液制品的現狀進行總結，為后續的研究提供到了可靠的依據。

4 層析技術的應用

4.1 白蛋白

當前生物柱層析理論的不斷發展，包裝的類型和設備水平的改善，層析技術越來越廣泛。其中，葡聚糖凝膠沒有任何物質交聯，瓊脂糖凝膠的凝膠層析技術，交聯陰離子交換配體（如 DEAE，QAE）或陽離子交換配體（CM，P，SP）離子交換和特定親和交聯賴氨酸，明膠，肝素和其他親和層析是最廣泛使用的血液產品的分離方法。這是應用這些層析技術，使得產品或組件的有效分離。理想的粗產物或儲備溶液可以僅在幾個過程中獲得。通過脫鹽，離子交換和分子篩由冷凍血漿制備白蛋白和纖維蛋白原;此外，通過膨脹的床技術分離白蛋白，纖維蛋白和纖維蛋白，通過膨脹的床技術分離 – 為這些實驗數據證實了層析分離在血液產品中的重要性和可操作性。白蛋白是血漿蛋白中最重要的蛋白質，3500-5500mg/dl 是從血漿中分離的第一種蛋白質，其廣泛用作臨床治療中的血漿擴容器。對血清白蛋白產品中雜質的不確定性，越來越多的研究者希望通過基因技術和細胞技術生產重組白蛋白，以克服上述問題，如原核表達和蛋白質異常折疊等，從血白蛋白中分離純化重組白蛋白是一種有效可行的方法。如今，常用的層析分離技術主要用于低溫乙醇層析，純化血液制品，如 1993 年 CLS 公司的 YAP。乙醇結合層析可以改善制備條件，縮短生產周期，促進工業生產。基本技術是通過乙醇沉淀制備血漿。組分 II 和 III 上清液是超級化的，S200 凝膠柱層析。半純產品的蛋白質含量，重新分配和乘客消毒純產品可達到 99.5%，高于低溫乙醇法制備的高于 90% 的制備。

4.2 內毒素及病毒的去除

在血漿中，免疫球蛋白是另一種富含的蛋白質，主要用于由自身抗體不足引起的疾病的臨床治療。當前 IVIG 的研究和應用，更改善的COHN 方法或 KISTLER.NITSCHMANN 方法，LIU 等人報道已用于免疫球蛋白分離技術。只有在溶解冷沉淀件組分后，已經使用了不同的沉淀方法，如果我們使用聚乙二醇沉淀，聚乙二醇再沉淀，乙酸沉淀，然后溶解，含有多肽的 AF- 氨基 650m 凝膠柱可以是親和層析有利于隨后的分離。雖然血液制品的原料來自健康人的血液，但目前的檢測方法仍然有限，不能完全保證血源的安全，因此，據報道，使用血液制品會引起血液傳播病毒，如 HIV、EB、HBV、HCV 等，因此，Horowitz 等人認為，除了加強原料的檢測外，病毒在制備過程中也是非常重要的，S/D 是FDA批準的用于病毒滅活的，但是后來的研究發現S/D方法只對脂質包膜的病毒有效，這意味著S/D方法對甲型肝炎和其他病毒沒有影響一些研究表明應該用辛酸鈉來滅活。

5 結束語

由上可知，為可以適應當時市場的變化，我們可以吸取到國外一些先進純化的工藝，才能夠有效創新和完善到我國的生產工藝和技術水平，最終有效提升產品的質量以及種類。

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