4 種柚子皮精油成分及其抑菌活性的研究

張方艷，葛國香，劉美伶，童 芳，朱桂蘭，郭 娜

（合肥師范學院，安徽 合肥 236001）

我國是世界最大的水果生產國，果業至少占全國農業總產值的20%。隨著水果加工工業的規模化和集約化，每年會產生大量的果皮。如果隨意丟棄，則造成嚴重的環境污染和資源的極大浪費。水果果皮中含有豐富的活性成分，若加以合理利用，可以變廢為寶，提高農產品的附加值，增加果農的經濟效益，更能夠消除污染源，有效解決果皮堆積造成的環境問題[1]。

柚是柑橘屬植物果實中非常重要的一大類，我國柚類品種豐富，包括琯溪蜜柚、沙田柚、文旦柚、梁平柚和香柚等品種，我國每年有大面積種植，主要分布在福建、廣東和浙江等地[2]。柚皮是柚子食用和加工的主要副產品，包括海綿狀的果皮和充滿油細胞的果皮，占柚子鮮質量的40%～50%。目前，除小部分柚皮外，大部分柚皮都被廢棄，造成資源的極大浪費。柚子果皮油包中含有豐富的芳香類物質，可以提取出一種強芳香味復合物，多為萜烯類、醛類、黃酮類和多酚類等化合物，其中主要成分為檸檬烯，具有抗菌等作用，這是一種還沒有得到充分開發利用的寶貴天然資源[3-6]。不同產地不同品種柚子皮中檸檬烯的含量及活性也不盡相同。因此，試驗以沙田柚、文旦柚、梁平柚和香柚為原料，對4 種柚皮精油的檸檬烯得率、含量及抑菌活性進行了對比探究，旨在為柚皮精油在蔬果保鮮技術中的應用進行探索，以期為柚皮在食品領域方面的相關應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

柚皮：4 種柚皮分別來源于玉環文旦柚（浙江）、梁平柚（重慶）、香柚（湖南）、沙田柚（湖南），2019 年4 月份網購于上述產地。

菌種（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、霉菌），合肥師范學院微生物實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、氫氧化鈉、瓊脂，均為分析純試劑；實驗用水，均為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

FA2204 型電子分析天平，上海市安亭電子儀器廠產品；7890B-5977A 型氣相質譜色譜聯用儀，安捷倫科技有限公司產品；揮發油提取裝置（冷凝管、10 mL 揮發油提取器、200 mL 圓底燒瓶），天長市千馬實驗設備有限公司產品；98-1-B 型電子調溫加熱套（200 mL），天津市泰斯特儀器有限公司產品；DNP-9162.1A 型恒溫培養箱、ZHP-Y2102F 型恒溫振蕩培養箱，上海三發科學儀器有限公司產品；SW-CJ-2FD 型（標準型） 雙人單面垂直凈化工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備產品；LDZM-80KCS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

新鮮柚子洗凈，陰涼處晾干，剝皮、切片，去除白色海綿狀部分和果肉，保留黃色外皮部分作為提取柚皮精油的材料。將柚皮切成0.1 cm×2 cm 長條，放入塑料密封袋中，置于冰箱中4 ℃下冷藏，備用。

1.3.2 柚皮精油的提取以及提取率計算

參照《中華人民共和國藥典》2010 年版一部附錄XD 甲法，精密稱取4 種柚皮各20 g，分別置于200 mL 裝有適量沸石的圓底燒瓶中，加入120 mL蒸餾水，振蕩混勻后，連接揮發油提取器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水，使揮發油測定器的U 形管內的水到達刻度線處，并出現有流入燒瓶內的現象時為止。放到電熱套中緩慢加熱至沸騰，然后調節電壓至100 V，保持微沸，從微沸起計時4 h（直到精油量不再增加后停止加熱），關閉電熱套電源，放置冷卻片刻，開啟提取器下端的活塞，將水緩慢放出，再靜置一段時間再開啟活塞，使精油收到棕色收集瓶中，并用無水硫酸鈉去除殘留水分，得到柚皮精油，裝瓶，密封，4 ℃冰箱中冷藏備用。

精油得率計算公式[7]：

式中：R——精油得率，%；

m1——精油質量，g；

m2——柚皮質量，g；

1.3.3 GC- MS 測試條件

色譜條件：色譜柱為安捷倫DB-5MS 型石英毛細柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；分流比為20∶1；載氣（99.999 %氦氣），流速1.0 mL/min；升溫程序：起始柱溫40 ℃，以10 ℃/min 的速率升到70℃，保持3 min，然后以3 ℃/min 的速率升到190 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 的速率升到250 ℃，保持3 min；壓力2.5 kPa，進樣量1.0 μL。

質譜條件：電子轟擊電子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度275 ℃，離子源溫度230 ℃，激活電壓1.5 V，質量掃描范圍50～500 m/z，溶劑延遲時間3 min[8]。

1.3.4 精油組分定性定量分析與相關性分析

利用質譜信息與標準信息庫NIST 11.0 進行相似度檢索和特征峰分析對比，定量分析采用峰面積歸一化法計算各種成分的相對含量。利用SPSS 24 軟件對柚皮精油中的主要抑菌物質（d - 檸檬烯） 與抑菌活性進行相關性分析。

1.3.5 柚皮精油抑菌效果研究

（1） 培養基的配制。配制牛肉膏蛋白胨培養基、PDA 培養基、枯草芽孢桿菌培養基，備用。

（2） 抑菌性測定。采用濾紙片抑菌圈法測定柚皮精油的抑菌效果：在濾紙上用打孔器制出直徑6 mm的圓形小紙片，高壓滅菌鍋滅菌后備用。將滅菌后的培養基冷卻至40 ℃左右后，倒入培養皿中，做好標記，放置自然冷卻，待培養基完全凝固后，向固體平板培養基中加入備用菌懸液100 μL，均勻涂布。緊接著，取滅菌小圓片貼在已涂布菌液的平板上，每片小圓片上滴加5 μL 的柚皮精油，每個平板均勻貼4 片。將平板放入培養箱，于37 ℃的條件下培養24 h，以浸無菌水的濾紙片作為空白對照。用游標卡尺交叉法測量抑菌圈直徑，平行3 次，結果取平均值[9-12]。根據抑菌圈直徑的大小判定組合物的抗菌敏感度。

2 結果與分析

2.1 4 種柚皮精油的提取率

4 種柚皮精油的提取結果見表1。

由表1 可以看出，4 種柚皮的精油提取率中文旦柚的提取率最高，為1.97%；其次是梁平柚和香柚，沙田柚的提取率最低，為1.56%，4 種柚皮精油的提取率為1.50%～2.00%。由此可見，這4 種柚皮精油的提取率有一定的差距，可能是由于不同品種柚皮的油胞含量的差異導致精油提取率的差別[13]。

表1 4 種柚皮精油的提取結果

郭暢等人[13]通過對水蒸氣蒸餾方法的改進，用改進型Clevenger 裝置也提取了沙田柚皮精油，精油得率為1.68%。劉昊澄等人[7]分別采用冷壓榨、水蒸氣蒸餾及機械磨皮3 種方法制備沙田柚皮精油，其中水蒸氣蒸餾的精油得率為1.68%。上述文獻報道均與試驗測得沙田柚精油得率結果具有一致性。

2.2 柚皮精油物質成分分析與鑒定

梁平柚皮精油可揮發性成分及相對含量見表2，沙田柚皮精油可揮發性成分及相對含量見表3，香柚皮精油可揮發性成分及相對含量見表4，文旦柚皮精油可揮發性成分及相對含量見表5。

表2 梁平柚皮精油可揮發性成分及相對含量

表3 沙田柚皮精油可揮發性成分及相對含量

表4 香柚皮精油可揮發性成分及相對含量

表5 文旦柚皮精油可揮發性成分及相對含量

由表2 可知，4 種柚皮精油成分的鑒定率分別為文旦柚97.81%，沙田柚98.66%，香柚98.00%，梁平柚95.22%，共檢出19 種化合物。4 種柚皮精油成分中的相同成分主要為d- 檸檬烯（55.34%～96.35%），β- 蒎烯（0.27%～35.30%） 等，其中d- 檸檬烯是所有樣品的主要化合物，其相對含量分別為梁平柚59.11%，沙田柚93.48%，香柚96.35%，玉環文旦55.34%。這4 種柚皮精油的化合物成分也存在一定的差異性，其中梁平柚檢測出16 種化合物，4 種柚皮精油中所含化合物種類最多，其中3 - 蒈烯（1.48%）、羅漢柏烯（0.55%） 等，僅在梁平柚精油中檢測到；苯甲酸- 2 - 甲基丙酯（0.65%）、鄰苯二甲酸二異丁酯（3.34%） 僅在沙田柚精油中檢測到；3,5 - 二叔丁基鄰苯二酚（0.2%）、3,4 - 環氧四氫呋喃（3.83%） 僅在文旦柚精油中被檢出。通過查閱相關文獻資料導致成分差異性的原因可能與產地、品種、貯藏條件、日照時間等因素相關，可以為柚皮中有機物的開發和利用提供參考。

2.3 柚皮精油抑菌活性

4 種柚皮精油的抑菌圈直徑見表6。

表6 4 種柚皮精油的抑菌圈直徑

由表6 可知，4 種柚皮精油對4 種受試菌的生長均有不同程度的抑制作用。整體上這4 種柚皮精油對酵母菌和霉菌抑制作用較明顯，對酵母菌的抑菌圈直徑為7～10 mm，對霉菌的抑菌圈直徑為7～9 mm。對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑制作用不太明顯，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑為1～2 mm。

2.4 相關性分析

d - 檸檬烯是柚類果皮精油中主要揮發性活性物質，具有抗氧化和抗菌等功效[14-16]。因此，為進一步了解4 種柚皮精油中的d - 檸檬烯含量與抑菌活性之間的關系，利用相關性分析對柚皮精油中d - 檸檬烯成分和抑菌活性間的相關系數進行了計算（如表7），除枯草芽孢桿菌（-0.237） 為弱相關以外，d - 檸檬烯含量與其余3 種細菌的抑菌活性之間有極強的正相關（0.811～0.923） 關系，所以這4 種柚皮精油表現出來的抑菌活性的差異性很可能與d - 檸檬烯的含量有關。

4 種柚皮精油的主要抑菌化合物與抑菌活性間的相關性系數見表7。

表7 4 種柚皮精油的主要抑菌化合物與抑菌活性間的相關性系數

柑橘屬植物精油是d - 檸檬烯最大的天然來源,其相對含量通常可達50%以上，在柚皮精油中可達95.82%[17]。d - 檸檬烯是一種天然的抗氧化劑和抑菌劑[17-18]，通常作為食用香精、香料被廣泛應用于食品工業中，研究表明d - 檸檬烯具有很強的抗氧化能力和抑菌能力。因此，d - 檸檬烯很可能是柚皮精油中起主導作用的活性成分，4 種柚皮精油的抑菌活性差異可能與其含有的d - 檸檬烯的含量有關。

3 結論

我國含有豐富的柚類資源，柚皮作為柚類果實主要的副產品，未能充分開發利用，造成資源浪費和環境污染。有研究表明，柚皮精油中含有d - 檸檬烯， 具有降血糖、降血脂、抗菌和抗氧化等藥理活性，能有效抑制各類微生物的生長，延長食品的保存期，而且具有良好的鎮咳、祛痰作用[19]。 因此，柚皮精油在食品加工、醫藥保健和日化生產等方面具有極大的開發潛能。選取了我國4 個地區4 個不同品種的柚子，對其果皮精油進行了提取、易揮發物質測定及抑菌活性測定。結果表明，文旦柚的得率最高，為1.97%；其次是梁平柚（1.89%）、香柚（1.61%），最低的是沙田柚（1.56%）。利用GC-MS方法檢測分析柚皮精油的組成成分，4 種精油共檢出19 種化合物，其中具有廣譜抑菌作用的d - 檸檬烯含量都高于50%，沙田柚和香柚中的d - 檸檬烯含量在90%以上。然后進行柚皮精油抑菌試驗，探究4 種柚皮精油的抑菌效果并進行比較，發現柚皮精油中d - 檸檬烯含量高的柚子品種的抑菌活性高，其中香柚精油對于酵母菌達到了中度敏感，4 種精油對于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現出較敏感。對柚皮精油中d - 檸檬烯含量和抑菌圈大小進行相關性分析，發現d - 檸檬烯含量與其余3 種細菌的抑菌活性之間呈極強的正相關（0.811～0.923） 關系。

綜上，4 種柚皮精油得率和主要成分d - 檸檬烯含量因產地、品種的不同而不同；柚皮精油中的d -檸檬烯具有抑菌性能，其抑菌性能與d - 檸檬烯含量呈正相關。試驗結果對柚皮精油的開發和應用提供一定的參考依據。