不同品種啤酒花對啤酒特征香氣物質的影響

王 茜，孫嬌嬌，侯 靜，彭丹丹，趙 育

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710119）

0 引言

啤酒花，是桑科葎草屬多年生草質蔓生藤本植物[1]，它可以賦予啤酒特征風味，影響啤酒的質量和口味，被譽為“啤酒的靈魂”[2]。啤酒花化學組分復雜，其中啤酒花精油、苦味酸和啤酒花多酚是國內外研究人員關注的重點，它們在啤酒生產過程中具有重要作用[3]，賦予啤酒特征風味的主要是啤酒花精油中的揮發性成分，啤酒花精油中也含有少量不易揮發的含硫化合物[4]；苦味酸中的異α - 酸、β - 酸的氧化物可以使啤酒具有爽口的苦味；啤酒花多酚可以提高啤酒的抗氧化能力，促進啤酒殺口感的形成。

在20 世紀60 年代就有國外研究人員對啤酒通過萃取濃縮等處理方法來對啤酒香味物質進行定性和半定量測定[5]。Inui T 等人[6]首次分析測定了啤酒花精油成分，確定了近250 種成分。近年來，Heinlein A 等人[7]分析了31 種啤酒花品種，確定了啤酒花香氣物質中的11 種重要成分。國內對于啤酒花的研究起步較晚，王憬等人[8]建立HS-SPME- GC-MS 方法分析啤酒中啤酒花香氣成分，從啤酒中準確定量了里哪醇、香葉醇、香茅醇、橙花叔醇、乙酸香葉酯、乙酸香茅酯、香葉酸甲酯這7 種香氣成分，并確認了里哪醇可以作為啤酒花香組分的標志性物質。王露等人[9]分析確定了影響啤酒香氣的里哪醇、香茅醇、香葉醇和橙花叔醇這4 種關鍵性萜烯醇，并初步揭示了啤酒釀造中香氣物質的變化規律。到目前為止，學者普遍認為啤酒香氣是由里哪醇、香葉醇、香茅醇等協同發揮作用的。然而，目前尚無對用不同啤酒花釀造啤酒中香氣物質的變化規律的比較及成品酒中風味物質的比較的研究。

馬格努門、薩茲、卡斯卡特和青島大花是4 種國內啤酒廠常用的啤酒花。試驗以上述4 種啤酒花進行啤酒釀造試驗，采用HS-SPME-GC-MS 法測定啤酒特征香氣物質在啤酒發酵過程中的演變規律，探究這4 種不同啤酒花釀造的啤酒特征香氣物質的差異及啤酒花對啤酒理化指標和感官的影響，以期為啤酒生產中啤酒花對啤酒特征香氣物質和品質的影響奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

90 型馬格努門顆粒啤酒花、90 型薩茲顆粒啤酒花、90 型卡斯卡特顆粒啤酒花、90 型青島大花顆粒啤酒花，新疆方睿啤酒原料制品有限公司提供；皮爾森基礎澳麥芽，永順泰麥芽有限公司提供；安琪啤酒活性干酵母CN36，安琪酵母股份有限公司提供。

主要試劑：香氣物質標準品（色譜級），美國Sigma 公司提供；乙醇（色譜級）、正丁醇（色譜級），天津市科密歐化學試劑有限公司提供；氯化鈉、鹽酸、異辛烷，天津市天力化學試劑有限公司提供。

1.2 主要儀器

7890B 型氣相色譜儀、7000C 型質譜儀，安捷倫科技有限公司產品；頂空固相微萃取裝置，意大利HTA 公司產品；JHW 型啤酒花粉碎機，北京藍伯斯科技有限公司產品；JMF-5A 型麥芽粉碎機，山東雙佳農牧機械科技有限公司產品；HH-S4 型數顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；雷磁Ph-SJ-4A 型pH 計，上海久世環保科技有限公司產品；TH-200BQ 型數控超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司產品；Anke TGL-16G 型飛鴿離心機，上海安亭科學儀器廠產品；T6 型新世紀紫外- 可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；GC-2010PLUS AF 230V 型島津氣相色譜儀，島津企業管理中國有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 啤酒釀造工藝流程[10-11]

麥芽粉碎→麥芽汁糖化→麥芽汁過濾→麥芽汁煮沸→麥芽汁澄清沉淀→麥芽汁冷卻→接入啤酒花→接入酵母菌→發酵→成品。

以不添加啤酒花的啤酒為空白對照組，添加4 種不同品種啤酒花的啤酒為試驗組，試驗共釀造5 種啤酒。此釀造工藝中，每種啤酒均將1 kg 麥芽采用增濕粉碎法粉碎。麥芽汁糖化采用浸出式糖化法，麥芽與水初始的質量比為1∶5，糖化分為4 個階段：第一階段，粉碎的麥芽在35～40 ℃水溫下保溫30 min，促進麥芽軟化和酶的活化；第二階段，升溫至52 ℃，保溫20 min，進行蛋白質分解；第三階段，攪拌升溫至65 ℃，保溫1 h，使α - 淀粉酶開始水解；第四階段，升溫至78 ℃，結束糖化。發酵分為2 個階段，第一階段溫度在12 ℃，當麥芽汁濃度降到4.5-5.0 °P 后，封罐保壓發酵，發酵時間為7 d；之后逐步降溫至4 ℃，將酒液進行低溫貯藏發酵，此階段發酵時間為14 d。各組啤酒中啤酒花添加量均為0.5 g/L。

1.3.2 啤酒花及酒樣中啤酒花特征物質的提取與檢測[12]

（1） 頂空固相微萃取。采用100 μm PDMS/DVB復合萃取頭對顆粒啤酒花和酒樣中的香味物質進行提取和富集。通過將待測具有揮發性的香氣化合物固定到聚乙烯纖維上進行提取和富集，從而獲取待測樣品中的揮發性的香味物質。

樣品前處理：啤酒酒樣冷卻至4 ℃并保持2 h，使揮發性啤酒花衍生的香氣成分的損失最小化。將冷啤酒倒入250 mL 錐形燒瓶中并通過超聲脫氣直至二氧化碳逸出不明顯。啤酒花顆粒于冷藏4 ℃冰箱，使用前JHW 型啤酒花粉碎機粉碎，現用現制。

將5 mL 等份的脫氣啤酒樣品或0.5 g 啤酒花樣品移到含有2 g NaCl 和0.1 mL 4 - 甲基- 2 - 戊醇（內標濃度5.0 mg/L） 的20 mL 玻璃小瓶中。然后，將樣品瓶用PTFE 涂覆的SPME 特異性隔膜磁體蓋密封并在分析中保存，直至分析。

將樣品瓶置于70 ℃加熱器中平衡30 min 后，將老化的萃取頭插入密封的樣品瓶中，頂空萃取40 min，然后在氣相色譜進樣口230 ℃解析3 min，采用GC-MS 分析其揮發性成分。

（2） 氣相色譜- 質譜分析。①GC 條件：石英毛細管色譜柱HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；起始溫度40 ℃，保留時間2.5 min，以5 ℃/min 升至240 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃并保留7.5 min；不分流進樣，載氣為He，流速1.0 mL/min。②MS 條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，進樣口溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質量范圍40～500 amu。

1.3.3 啤酒理化指標測定

（1） 色度的測定[13]。啤酒色度采用紫外- 可見分光光度法測定。酒樣以轉速4 000 r/min 離心7 min，將經離心后的啤酒樣品倒入10 mm 玻璃比色皿中，用蒸餾水調整零點，于波長430 nm 處測定吸光度。色度計算公式可表示如下:

式中：S——樣品的色度，EBC；

A430——樣品于波長430 nm 處的吸光度；

25——換算系數。

（2） pH 值的測定。pH 值采用ST5000 型pH 計測定，測定前待測酒樣需除氣。

（3） 苦味值的測定[14]。苦味值采用紫外分光光度法測定。取除氣后的酒樣50 mL，加入濃度為3 mol/L的鹽酸溶液5 mL，充分振蕩使其混合均勻，而后加入100 mL 異辛烷，再置于振蕩器上振蕩5 min，靜置5 min 分層后取上層乳狀液體，以轉速3 500 r/min離心15 min，取上清液于1 cm 石英皿中，用異辛烷調整零點，于波長275 nm 處測定吸光度。苦味值計算公式可如下表示：

苦味值（IBU） = A275×50.

式中：A275——樣品波長275 nm 處的吸光度；

50——換算系數。

（4） 酒精度的測定[15]。酒精度采用氣相色譜法測定，氣相色譜條件根據實驗室現有方法略作改進。將酒樣稀釋10 倍后進樣測定，以正丁醇（色譜級）作為溶劑。氣相色譜儀器為配FID 檢測器的GC-2010PLUS AF 230V 型島津氣相色譜儀。氣相色譜條件：HP-INNOWAX 毛細管柱型色譜柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm），柱溫采用程序升溫，60 ℃平衡3 min，10 ℃/min 升溫至120 ℃，平衡1 min；氣化室溫度210 ℃，檢測器溫度210 ℃，分流比28∶1；載氣（N2），流速80 mL/min；流量程序：氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min，尾吹30 mL/min；進樣1 μL，測定方法：外標法。

（5） 原麥芽汁濃度的測定[16]。依據GB/T 4928—2008 的方法，測出啤酒樣品的實際濃度，并以如下公式計算出啤酒樣品的原麥芽汁濃度。

式中：X——原麥汁濃度，°P；

A——酒精度含量質量分數，%；

E——實際濃度質量分數，%。

1.3.4 感官鑒評[17-18]

30 位經過感官鑒評訓練的學生對5 種存儲于4 ℃冰箱里的成品啤酒進行感官品評。

啤酒感官評分標準見表1。

表1 啤酒感官評分標準

2 結果與分析

2.1 不同啤酒花特征香氣組分對比

不同品種啤酒花特征香氣物質對比見表2。

表2 不同品種啤酒花特征香氣物質對比

對比同一啤酒花中的香氣成分可以看出，馬格努門和青島大花中香茅醇含量最高，而薩茲和卡斯卡特中香葉醇含量最高；對比不同品種啤酒花中的香氣成分可以看出，里哪醇、橙花叔醇、乙酸香葉酯和乙酸香茅酯含量最高的為馬格努門，香葉醇含量最高的為薩茲，香茅醇含量最高的為青島大花。

2.2 特征香氣物質在啤酒發酵過程中演變規律

啤酒釀造過程中特征物質的含量變化見圖1。

圖1 啤酒釀造過程中特征物質的含量變化

每隔2 d 檢測啤酒在0～8 d 發酵過程中特征香氣物質的含量，并以發酵20 d 的啤酒作為成品檢測。

由圖1 可知，馬格努門成品酒中里哪醇、香茅醇、乙酸香茅酯和香葉酸甲酯含量最高，分別為1.44，1.18，1.87，0.73 μg/L，因為馬格努門啤酒花中的特征香氣物質含量較高；薩茲啤酒、卡斯卡特啤酒和青島大花啤酒的特征香氣物質中含量最大的分別是香葉醇、乙酸香葉酯和橙花叔醇，其含量分別為5.97，0.31，2.43 μg/L；未添加啤酒花的空白組啤酒在發酵過程中沒有檢測到里哪醇、香葉醇、香茅醇和橙花叔醇等單萜醇類化合物，表明啤酒中單萜醇類的來源是啤酒花，酵母菌在發酵過程中不產生單萜醇類，且啤酒花可以給啤酒帶來更多的香葉酸甲酯、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯等萜烯酯類化合物以增強啤酒的風味。

由圖1（a） 可知，發酵時間在0～4 d 時，青島大花中橙花叔醇含量的上升較快，幅度超過其他啤酒花；4 d 之后橙花醇的含量趨于平穩，成品啤酒中橙花叔醇含量增長率為58.06%。由圖1（b） 可知，4 種添加啤酒花的啤酒中里哪醇含量在發酵過程中一直呈下降趨勢，成品啤酒中馬格努門的減少率達到了42.48%，試驗結果與Hanke S 等人[19]研究里哪醇在啤酒中減少率為50%～100%的結果較為接近。由圖1（c） 可知，當發酵時間為0～2 d 時，添加啤酒花的啤酒中香茅醇的含量快速上升；發酵2 d 后啤酒中的香茅醇開始下降，這可能是由于在發酵過程中里哪醇通過生物化學反應部分轉化為香茅醇[20]。由圖1（d） 可知，當發酵時間為0～6 d 時，添加啤酒花的啤酒中香葉醇含量快速下降；發酵時間為6～8 d時，啤酒中香葉醇的含量增加為2.0 μg/L，之后啤酒中香葉醇的含量變化不明顯，成品酒中香葉醇下降率為76.92%。由圖1（e） 和圖1（f） 可知，5 種啤酒在發酵過程中香葉酸甲酯和乙酸香茅酯含量均呈現出先上升后下降的趨勢，發酵4 d 時卡斯卡特中香葉酸甲酯含量最高，發酵6 d 時馬格努門中乙酸香茅酯含量最高，成品啤酒中馬格努門的香葉酸甲酯和乙酸香茅酯含量最高。由圖1（g） 可知，5 種啤酒中的乙酸香葉酯整體呈現緩慢上升的趨勢，成品啤酒中卡斯卡特啤酒的乙酸香葉酯含量最高。

特征香氣物質方差分析及統計量見表3。

表3 特征香氣物質方差分析及統計量

對成品啤酒的特征香氣物質進行差異性分析，不同啤酒花釀造的啤酒中里哪醇、香葉醇、乙酸香葉酯和乙酸香茅酯差異顯著，橙花叔醇、香葉酸甲酯和香茅醇不存在顯著差異。乙酸香葉酯和乙酸香茅酯的感官閾值高于里哪醇和香葉醇的感官閾值，在同等含量水平下酯類的香氣更難被消費者感知到，因此里哪醇和香葉醇對啤酒特征香氣的貢獻大于乙酸香葉酯和乙酸香茅酯的貢獻，在5 組啤酒樣品中對啤酒特征香氣貢獻最大的是里哪醇，其次是香葉醇。

2.3 啤酒中啤酒花特征香氣物質組分分析

對5 組啤酒的7 種特征香氣物質進行主成分分析[21]，得到主成分的特征值和貢獻率。按照提取主成分的個數一般要求其累計方差貢獻率超過75%的原則，存在2 個特征值> 1 的主成分，累計貢獻率達92.099%。

主成分的特征值及其貢獻率見表4，主成分載荷矩陣見表5。

表4 主成分的特征值及其貢獻率

表5 主成分載荷矩陣

主成分因子1 中主要有里哪醇、香葉醇、香茅醇、橙花叔醇和乙酸香葉酯，其相關系數分別為0.981，0.899，0.970，0.968，0.791，在主成分1 中起正相關作用，表明里哪醇是啤酒香氣中一種重要物質，且可以作為一種標志性化合物來評價啤酒香氣[22]。主成分因子2 中主要有乙酸香茅酯和香葉酸甲酯，其相關系數分別為0.813 和0.694，在主成分2中起正相關作用。

5 種啤酒的主成分散點圖見圖2。

圖2 5 種啤酒的主成分散點圖

青島大花落在第一象限，卡斯卡特和馬格努門落在第二象限，空白組落在第三象限，薩茲落在第四象限。5 組啤酒落點相距較遠，表明5 組啤酒的香氣物質含量和風味特征存在差異。

2.4 成品啤酒感官品評及理化指標分析

根據表1 啤酒感官評分標準對5 種成品啤酒進行感官鑒評。

不同品種啤酒花釀造啤酒感官評分雷達圖見圖3。

圖3 不同品種啤酒花釀造啤酒感官評分雷達圖

5 組啤酒的外觀色澤無明顯差異，酒體均呈淡黃色，清澈透亮，無渾濁感；添加啤酒花的啤酒泡沫特性明顯優于不加啤酒花的啤酒。感官鑒評結果與以上GC-MS 測定的啤酒花中的特征香氣物質結果相符。馬格努門帶有較濃的玫瑰花香和蘋果香味，酯香濃郁、苦味充足、泡沫細膩、口感協調柔和、殺口感適中，這是因為馬格努門中含有大量可以賦予啤酒花香和水果香的里哪醇、香茅醇、乙酸香茅酯和香葉酸甲酯。薩茲啤酒有一種淡淡的花香，酒花香和酯香融合均勻協調，苦味比較適中，口感平衡，清爽可口，這是因為薩茲含有較多的香葉醇。卡斯卡特啤酒因其乙酸香葉酯含量較高表現出玫瑰香和丁香味，苦味一般，殺口感略微不足。青島大花啤酒具有藥草香和微異雜味，啤酒花香和酯香表現一般，苦味稍顯粗糙、口感偏清爽。不添加啤酒花的空白組啤酒不存在里哪醇、香葉醇等單萜醇和酯類，因此口感寡淡。

不同品種啤酒花釀造啤酒理化指標分析見表6。

表6 不同品種啤酒花釀造啤酒理化指標分析

對啤酒成品進行理化指標分析，不同啤酒的原麥芽汁濃度、酒精度、色度沒有顯著性差異，說明啤酒花種類對啤酒的原麥芽汁濃度、酒精度、色度無明顯影響。苦味值存在明顯差異，原因是不同品種啤酒花所含α - 酸含量不同，在發酵過程中異構化程度也可能不相同，最終導致成品啤酒中的苦味物質含量有差異[23-24]。

3 結論

以皮爾森基礎澳麥芽為原料，分別添加馬格努門、薩茲、卡斯卡特、青島大花4 種單一啤酒花釀造拉格啤酒，測定里哪醇、香葉醇、香茅醇、橙花叔醇、乙酸香葉酯、乙酸香茅酯、香葉酸甲酯等7 種特征香味物質在啤酒發酵過程的變化量，里哪醇和香葉醇的含量在成品啤酒中顯著下降，馬格努門中里哪醇和卡斯卡特中香葉醇含量下降最多，下降率分別為42.48%和76.92%；添加啤酒花的啤酒在發酵過程中香茅醇、橙花叔醇、乙酸香葉酯、乙酸香茅酯、香葉酸甲酯的含量總體上呈上升趨勢。在添加啤酒花的啤酒中檢測到單萜醇類且萜烯酯類含量較未添加啤酒花時明顯增加，表明啤酒中單萜醇類的來源是啤酒花。在對啤酒香氣物質進行主成分分析時，確定了里哪醇是啤酒中一種重要的香氣物質，在對成品啤酒進行理化指標測定時發現啤酒花會對啤酒的苦味值產生較大影響。研究結果為啤酒生產中啤酒花對啤酒特征香氣物質和品質的影響奠定了理論基礎，為啤酒廠對啤酒花的選擇提供一定的參考依據和理論支持，具有十分重要的實際意義。