銀杏葉黃酮的閃式提取工藝優化及抗氧化活性分析

曾思漫，崔 玨

（徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221000）

銀杏（Ginkgo biloba L.） 為銀杏科銀杏屬的植物，其葉子主要用來制備藥物銀杏葉提取物（GBE）。多項研究證明，銀杏黃酮是GBE 中重要的活性成分，具有顯著的抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、神經保護等作用[1]。目前，采用液相色譜- 質譜聯用技術已經從銀杏葉中分離鑒定出了110 多種黃酮成分，存在形式主要為游離的黃酮苷元、黃酮苷和雙黃酮3 類。其中，黃酮苷元主要包括槲皮素、山奈酚、異鼠李素、丁香黃素、楊梅素、西伯利亞落葉松黃酮、萬壽菊素、芹菜素、木犀草素、黃芩素、柚皮素、圣草酚、染料木素、兒茶素等。而銀杏葉中存在的雙黃酮主要包括銀杏素、異銀杏素、雙葉甜菜素和香豆黃酮。研究證實這些雙黃酮對人體凝血酶活性、胰脂肪酶、脂肪生成也有較強的抑制作用[2]。以上研究結果說明，銀杏葉黃酮具有重要的藥用價值和經濟價值。

試驗以銀杏葉黃酮得率為指標，通過單因素試驗和正交試驗設計優化銀杏葉黃酮閃式提取的最佳提取工藝，同時對提取的銀杏葉黃酮的體外抗氧化活性進行研究，以期為高效提取銀杏葉黃酮提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉，購于安徽亳州中藥材交易中心；蘆丁標準品、DPPH、ABTS，上海源葉生物科技有限公司提供；亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

閃式提取儀，河南智晶生物科技有限公司產品；BJ-800A 型粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司產品；DT-1 型電子天平，賽多利斯科學儀器公司產品；UV-2600 型紫外可見分光光度，日本島津公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀杏葉黃酮含量的測定和提取率計算

以蘆丁為對照品測定銀杏葉提取物中的黃酮含量。取銀杏葉提取液0.8 mL，依次加入50%乙醇1.9 mL 和5%NaNO2溶液0.15 mL 后混勻，于37 ℃下避光反應6 min，反應后再加入10% Al（NO3）3溶液0.15 mL，繼續于37 ℃下避光反應6 min，最后加入1 mol/L NaOH 溶液2.0 mL，于37 ℃下避光反應10 min 后，于波長510 nm 處檢測吸光度。

銀杏葉黃酮提取率計算公式如下：

1.2.2 閃式提取銀杏葉黃酮的單因素試驗

（1） 不同體積分數乙醇對銀杏葉黃酮提取率的影響。分別取4 g 銀杏葉粉，在電壓100 V，提取時間40 s，料液比1∶10（g∶mL） 的條件下，分別加入體積分數為50%，60%，70%，80%，90%的乙醇，進行閃式提取銀杏葉黃酮。

（2） 不同料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響。分別取4 g 銀杏葉粉，在電壓100 V，提取時間40 s的條件下，分別按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 的料液比加入70%的乙醇，進行閃式提取銀杏葉黃酮。

（3） 不同提取時間對銀杏葉黃酮提取率的影響。分別取4 g 銀杏葉粉，在電壓100 V，料液比1∶15的條件下，分別在20，40，60，80，100 s，進行閃式提取銀杏葉黃酮。

1.2.3 閃式提取銀杏葉黃酮的正交試驗

根據單因素試驗的結果，采用正交試驗設計，以乙醇體積分數、料液比、提取時間為影響因素，以銀杏葉黃酮提取率為考查指標，對閃式提取工藝進行優化。

1.2.4 DPPH 自由基清除試驗

測定方法參考文獻并適當修改[3]。稱取20.00 mg DPPH 溶于500 mL 甲醇。將銀杏葉黃酮提取液和對照品溶液（1.0 mg/mL） 200 μL，加入3.8 mL DPPH 溶液，于37 ℃下避光反應60 min 后，于波長517 nm 處測吸光度As。測DPPH 溶液與0.2 mL 蒸餾水的吸光度A0，以水溶液為對照品。據下列公式計算樣品對DPPH 的抑制率。

1.2.5 ABTS 自由基清除試驗

測定方法參考文獻并適當修改[4]。將7 mmol/L 的ABTS 溶液5 mL 和140 mmol/L 的過硫酸鉀溶液88 μL兩者進行混合，在室溫條件下進行12 h 的避光反應，制備成的溶液即為ABTS 自由基的儲備液。檢測時，于波長735 nm 下，用乙醇將儲備液稀釋為吸光度處于0.7±0.02 的范圍的工作液。取25 μL 銀杏葉黃酮提取液加入ABTS 自由基的工作液250 μL，迅速振蕩35 s 使其混合均勻，于波長735 nm 處測定其吸光度（Ai）。再以同等體積的試劑（A0）、無水乙醇（Aj） 分別作為對照組進行同等條件下的吸光度測定。ABTS 自由基的清除率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 銀杏葉黃酮閃式提取工藝條件單因素試驗結果

2.1.1 料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數為70%，提取時間40 s 的條件下，進行料液比對銀杏葉黃酮提取率影響的單因素試驗。

料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對銀杏葉黃酮提取率的影響

由圖1 可知，銀杏葉黃酮提取率隨著料液比增大而顯著增加，但當料液比大于1∶15 之后，提取率增加不明顯。因此，1∶15 為最佳料液比。

2.1.2 乙醇體積分數對銀杏葉黃酮提取率的影響

在料液比1∶15，提取時間40 s 的條件下，進行乙醇體積分數對銀杏葉黃酮提取率影響的單因素試驗。

乙醇體積分數對銀杏葉黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對銀杏葉黃酮提取率的影響

由圖2 可知，提取劑乙醇的體積分數較低時，黃酮提取率隨乙醇體積分數增加而增大，當乙醇體積分數為70% 時黃酮提取率最高，當乙醇體積分數進一步增加提取率反而下降。因此，確定體積分數為70%的乙醇為最佳提取溶劑。

2.1.3 提取時間對銀杏葉黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數70%，料液比1∶15 條件下，進行提取時間對銀杏葉黃酮提取率影響的單因素試驗。

提取時間對銀杏葉黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對銀杏葉黃酮提取率的影響

由圖3 可知，在60 s 內，隨著提取時間的延長，提取率也隨之增大。當提取時間為40～60 s 時，提取率達最大值。當提取時間繼續延長，黃酮提取率略有降低，推測高速剪切產生的熱效應可影響黃酮的穩定性。因此，銀杏葉黃酮閃式提取的時間應控制在60 s 左右。

2.2 銀杏葉閃式提取的正交試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，進行正交試驗對銀杏葉黃酮的閃式提取工藝進行優化。以乙醇體積分數、料液比、提取時間作為影響因素，進行了三因素三水平的正交試驗，各因素水平數分別為乙醇體積分數（A） 分別取60%，70%，80%；料液比（B）為1∶10，1∶15，1∶20；提取時間（C） 分別是40，60，80 s。

閃式提取銀杏葉黃酮的正交試驗見表1。

表1 閃式提取銀杏葉黃酮的正交試驗

由極差R 值可知，3 個因素對銀杏葉黃酮提取率的影響大小順序為B>A>C。根據各因素的K 值可知，銀杏葉黃酮閃式提取的最佳提取條件為A2B2C1，即乙醇體積分數70%，料液比1∶15，提取時間40 s。分別以正交試驗優化所確定的最優提取方案和單因素試驗得出的最優提取條件組合，進行3 次驗證試驗。在正交試驗獲得的最優方案提取條件下，所得的銀杏葉黃酮提取率略高于3 個單因素試驗的最優組合方案的黃酮提取率。因此，銀杏葉黃酮閃式提取的最優提取工藝為乙醇體積分數70%，料液比1∶15，提取時間40 s。

2.3 銀杏葉黃酮清除DPPH 自由基試驗結果

銀杏葉提取物對DPPH 自由基清除率的影響見圖4。

圖4 銀杏葉提取物對DPPH 自由基清除率的影響

由圖4 可知，在0～200 μg/mL 質量濃度內，銀杏葉黃酮提取物表現出較好的清除DPPH 自由基的能力，清除能力隨著黃酮提取物質量濃度的增大而增強，當其質量濃度達到200 μg/mL 時，DPPH 自由基清除率最大可達80.31%。

2.4 銀杏葉黃酮清除ABTS 自由基試驗結果

銀杏葉提取物對ABTS 自由基清除率的影響見圖5。

圖5 銀杏葉提取物對ABTS 自由基清除率的影響

由圖5 可知，在0～200 μg/mL 質量濃度內，銀杏葉黃酮提取物表現出較好的清除ABTS 自由基的能力，清除能力隨著黃酮提取物質量濃度的增大而增強，當其質量濃度達到200 μg/mL 時，ABTS 自由基清除率最大可達66.46%。

3 結論

通過單因素試驗、正交試驗優化獲得了銀杏葉黃酮閃式提取的最優工藝條件，即乙醇體積分數70%，料液比1∶15，提取時間40 s。在此條件下，銀杏葉黃酮的提取率為3.99%。該方法制備的銀杏葉黃酮具有較好的清除DPPH 和ABTS 自由基的活性。試驗結果可為銀杏葉黃酮的高效制備提供理論參考依據。