UPLC-MS 測定抹茶主要特征成分研究

蒲首丞，胡美娟，陳夢露，鄭 治，尹新忠

（1. 浙江華仕達茶業股份有限公司，浙江 武義 321200；2. 浙江華茗園茶業有限公司，浙江 永康 321300；3. 浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江金華 321000；4. 浙江省永康市食品與藥品檢測中心，浙江永康 321300）

0 引言

近年來，抹茶作為一種健康天然飲品，受到人們的歡迎，由于覆蓋栽培及特殊加工方法，抹茶極大地保持了綠茶鮮葉原有的天然色澤及營養保健功效成分。抹茶保留了茶葉中的100 多種成分，主要為茶多糖、茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸、葉綠素、蛋白質、芳香物質、纖維素，還有大量的維生素和礦物質，其中茶氨酸和葉綠素含量都比較高，這些生物活性成分使得抹茶具有改善血液流動、改善心血管疾病、緩解壓力、安眠功效、降血脂、降血糖等作用[1-2]。茶氨酸和茶多酚是抹茶主要成分，茶氨酸（N - 乙基γ - 谷氨酰胺） 是一種酰胺類化合物，天然存在的茶氨酸均為L 型，是茶葉中特有非蛋白類氨基酸，具有穩定的化學性質及非常高水溶性，占茶葉中游離茶氨酸的一半作用，可以減弱茶的苦澀味，增加茶鮮美的味道，可作為一種食品添加劑使用[2-4]。許多科學研究表明，茶氨酸具有增強人體免疫力、降低血壓、抑制癌細胞生長、保護神經細胞、抑制神經元的凋亡、松弛神經緊張、安神作用等作用[4-7]。目前，關于茶多酚研究比較多，特別是兒茶素類活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗高血壓等作用[8]。

基于UPLC-MS 測定抹茶中主要6 種特征性成分，主要包括茶氨酸和兒茶素類成分，分析2020 年春茶同一茶園不同時間段抹茶主要成分變化，通過聚類分析不同時間段的樣品，以期為抹茶質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

抹茶，2020 年春茶（鳩坑）。

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；水；標準品：茶氨酸（L-The）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG），上海安譜試驗科技股份有限公司提供；咖啡堿（CAF），中國計量科學研究院提供。

1.1.3 儀器設備

JYL-C020E 型多功能料理機，九陽股份有限公司產品；FA2004 型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；TG16-WS 型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司產品；HH-600 型數顯恒溫循環水箱，常州智博瑞儀器制造有限公司產品；1290 Infinity 型超高效液相色譜儀、色譜柱（ZORBAX Eclipse Plus C18型，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、保護柱（ZORBAX Eclipse Plus C18型，2.1mm×50 mm，1.8μm），安捷倫公司產品；4500 型三重四極桿質譜TRIPLE QUAD 4500，AB Sciex 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品制備

標液：精確稱取標準物質各10.0 mg，分別用70%甲醇水溶解后定容至10 mL 棕色容量瓶中，得質量濃度為1 000 μg/mL 儲備母液，不同質量濃度混合標準品溶液用儲備母液稀釋配制。

混和標準品溶液見表1。

表1 混和標準品溶液

1.2.2 供試品制備

供試液：稱取0.2 g 樣品，加入在70 ℃預熱過的70%甲醇溶液50 mL，混于100 mL 錐形瓶中，于70 ℃水浴中浸提20 min（5 min 攪拌1 次），冷卻后轉移到100 mL 容量瓶中，用70%甲醇水定容至刻度，搖勻。移液管移取1 mL 上清液于100 mL 容量瓶中，用70%甲醇水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.2.3 UPLC- MS 分析條件

（1） 色譜條件。流動相：乙腈（流動相A）、0.1%甲酸水溶液（流動相B），流速0.2 mL/min，進樣量1 μL，柱溫40 ℃，運行時間15 min。

流動相梯度見表2。

表2 流動相梯度

（2） 質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），掃描模式：正離子模式，掃描方式：多反應離子監測（MRM），離子化電壓5 500 V，加熱溫度450 ℃，噴霧氣GS1 50 psi，輔助加熱氣GS2 50 psi，碰撞氣CAD 8，氣簾氣CUR35 psi，MRM離子對信息。

MRM離子對信息見表3。

表3 MRM 離子對信息

1.2.4 方法學考查

（1） 線性關系考查。精密吸取不同質量濃度混合標準照品溶液分析，1 μL 進樣，測其峰面積，以標準溶液的進樣含量為橫坐標，以峰面積為縱坐標作圖，得到線性回歸方程，求相關系數R。

（2） 精密度試驗。精密吸取配制的對照品溶液1 μL 進樣，依上述色譜條件測定，重復進樣6 次，測定計算目標峰面積，計算RSD 值。

（3） 穩定性試驗。取制備的供試樣品溶液，于0，2，4，6，8，10 h 進樣測定，按1.2.3 色譜分析條件，進樣量為1 μL，測定目標峰面積，計算RSD 值。

（4） 重復性試驗。取樣品按1.2.2 方法制備供試品溶液6 份，按1.2.3 色譜分析條件，進樣量為1 μL，測定峰面積，計算RSD 值。

（5） 加樣回收試驗。精密稱取已知含量的茶樣品3 份，分別精密加入一定量高中低對照品，按

1.2.2 供試品溶液制備方法制備樣品溶液，依上述色譜條件測定含量。

1.2.5 樣品含量測定

取不同時間段采集生產加工抹茶，以1.2.2 進行前處理，在按1.2.3 色譜分析條件進行測定，檢測不同抹茶樣品中的茶氨酸、兒茶素類和咖啡因含量。

1.2.6 聚類分析

以6 批樣品的7 個主要特征成分含量為指標，運用SPSS19 統計分析軟件，進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考查

2.1.1 線性關系考查

混合標準品UPLC-MS 色譜圖見圖1，線性回歸方程和相關系數見表4。

圖1 混合標準品UPLC-MS 色譜圖

表4 線性回歸方程和相關系數

圖1 為混合標準品UPLC-MS 色譜圖，表4 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG 和ECG 的色譜保留時間標準曲線回歸方程、相關系數和線性范圍。結果表明，抹茶中7 種化合物靈敏度較高，在給定的質量濃度范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度試驗

精密度、穩定性和重復性試驗相對標準偏差RSD 值見表5。

表5 精密度、穩定性和重復性試驗相對標準偏差RSD 值/%

表5 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG和ECG 的精密度試驗RSD 值，分別為2.83%，4.42%，1.67%，2.03%，0.92%，3.66%和1.96%，結果表明試驗儀器要具有較好的精密度。

2.1.3 穩定性試驗

取制備的供試樣品溶液于0，2，4，6，8，10 h進樣測定，表5 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG 和ECG 的穩定性試驗RSD 值，分別為5.74%，3.75%，4.36%，3.09%，2.58%，7.44%和3.39%，供試品溶液中EGCG 的穩定性沒有其他成分高。

2.1.4 重復性試驗

表5 中是L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG和ECG 的供試品重復性試驗RSD 值，分別為1.91%，2.24%，4.16%，6.55%，1.51%，1.98%和1.34%，表明茶樣具有較好重復性。

2.1.5 加標樣回收試驗

添加1 mL 選擇已知質量分數的樣品作為本底樣品，在本底樣品中準確加入低、中、高3 個質量濃度的混標，然后進行分析。

7 種多酚物質的加標樣回收率分析見表6。

表6 7 種多酚物質的加標樣回收率分析

2.2 不同時間樣品含量測定

樣品含量分析見表7。

表7 樣品含量分析/ mg·g-1

采用該方法測定的浙江武義同一個茶園不同時期生產抹茶樣品7 種特征化合物，其中茶氨酸變化最明顯，下降最多，兒茶素類呈現緩慢降低，具體結果見表7。前3 d，茶葉中茶氨酸的含量較高為24 mg/g，在5 d 后茶氨酸含量降低50%左右，為13 mg/g，與感官審評結果相符合，前3 d 抹茶滋味清鮮、略帶海苔味，后幾天茶樣微澀，也與其他科研人員關于茶氨酸對抹茶品質呈正相關的研究一致[9]。

2.3 聚類分析

以抹茶主要特征成分L-The，EGC，C，CAF，EC，EGCG 和ECG 為指標，采用組間聯接法、平方Euclidean 距離度量標準進行系統聚類分析。

聚類分析見圖2。

圖2 聚類分析

當距離大于15 時，樣品可分為2 類，其中day1和day3 抹茶為一類，day5，day7，day9 和day11 聚為一類；當距離在10 左右時，可將6 個時間短樣本很好的分為3 類，其中day1 和day3 抹茶仍為一類，day5，day7，day9 聚為一類；day11 單獨聚為一類。由此可見，不同生長時間段抹茶的主要特征生化成分隨時間在不停變化，其中茶氨酸變化最大，通過統計聚類分析可以很好地區分不同時間段抹茶，對抹茶等級劃分具有較好指導意義。

3 結論

建立了UPLC-MS 同時測定抹茶中7 特征性化合物的分析方法，具有靈敏度高、準確穩定、方便快捷等特點，適合于茶葉中茶氨酸兒茶素和咖啡堿類化合物的快速測定。